體外基因修飾系統(tǒng)藥學(xué)研究與評價技術(shù)

指導(dǎo)原則（試行）

國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心

2022年5月

 目 錄

一、前言
二、適用范圍

三、一般原則

四、風(fēng)險評估與控制

五、基因修飾系統(tǒng)的設(shè)計、制備和質(zhì)量控制

六、穩(wěn)定性研究與直接接觸性容器/材料研究

七、參考文獻(xiàn)

一、前 言

近年來，細(xì)胞治療和基因編輯等技術(shù)手段蓬勃發(fā)展，相關(guān)臨床醫(yī)療探索不斷深入，為嚴(yán)重和難治性疾病提供了新的治療理念和方法。日益增加的臨床需求促進(jìn)了基因操作新技術(shù)的應(yīng)用和更新。

在人體外，采用基因工程技術(shù)構(gòu)建的修飾系統(tǒng),可有效地將遺傳物質(zhì)等轉(zhuǎn)入特定目的細(xì)胞，用于修飾目的細(xì)胞的遺傳物質(zhì)、改變基因表達(dá)方式或調(diào)節(jié)細(xì)胞生物特性等。目前，慢病毒載體、γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等常見用于將嵌合抗原受體（Chimeric Antigen Receptor, CAR）基因?qū)?T 細(xì)胞，以實現(xiàn) CAR-T 細(xì)胞對腫瘤的靶向殺傷；游離型載體（Episomal Vector）、仙臺病毒載體等可用于將轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入細(xì)胞，通過重編程獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，為其衍生細(xì)胞產(chǎn)品的生產(chǎn)提供起始原材料。將來，預(yù)計會有更多樣的載體設(shè)計適用于不同類型的產(chǎn)品。

基因修飾系統(tǒng)種類多樣，載體設(shè)計、制備過程以及質(zhì)量控制等方面的差異直接影響到最終產(chǎn)品的安全性和有效性，且其來源可能不同，質(zhì)量管理體系存在差異。為保證基因修飾系統(tǒng)質(zhì)量符合臨床應(yīng)用的要求，需對其進(jìn)行充分的質(zhì)量研究。因此，有必要細(xì)化不同類型基因修飾系統(tǒng)藥學(xué)研究的技術(shù)要求。

本指導(dǎo)原則基于當(dāng)前的科學(xué)認(rèn)知，針對體外用基因修飾系統(tǒng)提出申報上市階段的建議性技術(shù)要求，旨在為研發(fā)單位提供指導(dǎo)意見，同時，也作為監(jiān)管機構(gòu)評價的重要參考。本指導(dǎo)原則不具有強制性，若有可替代或適用的其他研究方法，或本指導(dǎo)原則中有不適用的內(nèi)容，申請人/持有人可提供相應(yīng)說明及相關(guān)替代研究的支持理由和依據(jù)。隨著技術(shù)的發(fā)展、認(rèn)知的深入和經(jīng)驗的積累，針對本指導(dǎo)原則內(nèi)容后續(xù)將逐步修訂和完善。

二、適用范圍

本指導(dǎo)原則中，基因修飾系統(tǒng)指在人體外，將外源基因等導(dǎo)入細(xì)胞，通過添加、替代、補償、阻斷、修正特定基因從而為獲得細(xì)胞治療產(chǎn)品或細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)用種子細(xì)胞而使用的修飾系統(tǒng)?？赡艿淖饔脵C制包括細(xì)胞內(nèi)表達(dá)功能性目的基因，或采用基因敲除、修復(fù)、插入等核苷酸編輯方式改變特定的基因序列等。

目前，基因修飾系統(tǒng)包括慢病毒、γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、仙臺病毒等病毒載體，以及 DNA、RNA、蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-RNA 復(fù)合物等非病毒基因修飾系統(tǒng)。本指導(dǎo)原則對病毒載體類和非病毒載體類兩類基因修飾系統(tǒng)進(jìn)行論述。隨著本領(lǐng)域技術(shù)的不斷更迭，新的基因修飾系統(tǒng)也可能應(yīng)用，如適用，其藥學(xué)研究也可參考本指導(dǎo)原則。

三、一般原則

基因修飾系統(tǒng)的設(shè)計合理性、工藝穩(wěn)定性、質(zhì)量可控性可直接影響細(xì)胞終產(chǎn)品的安全性和有效性，是藥學(xué)研究的重點。需要開展的藥學(xué)研究，可能包括上游設(shè)計、制備工藝、質(zhì)量研究與控制、穩(wěn)定性研究等多個方面。基因修飾系統(tǒng)的制備全過程原則上應(yīng)符合藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）的要求，具體的要求根據(jù)其使用情形的不同可具體問題具體分析。

基因修飾系統(tǒng)的質(zhì)量風(fēng)險雖與體內(nèi)基因治療產(chǎn)品有相似之處，但又有別于體內(nèi)基因治療產(chǎn)品。體外基因修飾后的細(xì)胞還可能經(jīng)過體外培養(yǎng)、換液清洗步驟，在應(yīng)用于人體之前還要經(jīng)過細(xì)胞終產(chǎn)品放行檢測。因此，基因修飾系統(tǒng)相較于體內(nèi)基因治療產(chǎn)品，其修飾特性可能在回輸前得到控制，一些相關(guān)的雜質(zhì)殘留可以經(jīng)過質(zhì)量控制后進(jìn)行放行，需要結(jié)合其特點開展體外基因修飾系統(tǒng)的設(shè)計和質(zhì)量研究與控制。

（一）不同研發(fā)階段的一般要求

同其他藥物的研發(fā)一樣，基因修飾系統(tǒng)的藥學(xué)研究也具有階段性、漸進(jìn)性等特征，隨細(xì)胞終產(chǎn)品非臨床和不同臨床試驗階段研究的推進(jìn)而變化。研發(fā)者應(yīng)提前制定研究計劃和策略，鼓勵按照“質(zhì)量源于設(shè)計”的理念進(jìn)行相關(guān)研究，隨著研發(fā)深入，逐步優(yōu)化制備工藝，加強質(zhì)量控制。

臨床試驗申報階段，需識別和控制基因修飾系統(tǒng)的相關(guān)風(fēng)險，明確其分子設(shè)計，完成生產(chǎn)用種子（如適用）的建庫和檢定，初步評估選用生產(chǎn)用原材料的合理性和安全性，通過工藝研究建立相對穩(wěn)定的制備工藝，開展相應(yīng)的質(zhì)量研究，建立適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以確保基因修飾系統(tǒng)及其所修飾細(xì)胞臨床應(yīng)用的安全性。

基因修飾系統(tǒng)應(yīng)用于申報上市階段的細(xì)胞產(chǎn)品時，隨著對工藝和質(zhì)量屬性認(rèn)識的加深，工藝不斷優(yōu)化，經(jīng)過充分的工藝開發(fā)及驗證研究確定基因修飾系統(tǒng)的商業(yè)化工藝。

如果在臨床試驗期間，基因修飾系統(tǒng)的工藝發(fā)生變更，需完成基因修飾系統(tǒng)和相應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)品的可比性研究；建議在確證性臨床試驗前，完成重大變更，并確定工藝?；诔浞稚钊氲馁|(zhì)量研究和多批次數(shù)據(jù)積累，制定合理的質(zhì)量控制策略，明確關(guān)鍵質(zhì)量屬性（Critical Quality Atribute，CQA），確定適宜的分析方法，進(jìn)行全面的方法學(xué)驗證；同時，應(yīng)關(guān)注修飾系統(tǒng)相關(guān)或工藝相關(guān)的雜質(zhì)研究，并制定相應(yīng)的風(fēng)險控制策略。規(guī)范開展并完成穩(wěn)定性研究和包材相容性研究，制定合理的貯存條件和時間。

（二）不同來源基因修飾系統(tǒng)的一般要求

基因修飾系統(tǒng)可能存在自行生產(chǎn)、委托生產(chǎn)、購買等多種來源，不同來源基因修飾系統(tǒng)遵循相同的技術(shù)要求和質(zhì)量控制原則，藥學(xué)研究均可參考本指導(dǎo)原則開展。

細(xì)胞終產(chǎn)品的上市許可持有人應(yīng)對基因修飾系統(tǒng)的質(zhì)量負(fù)主體責(zé)任，通過加強內(nèi)部質(zhì)量控制或?qū)蛐揎椣到y(tǒng)生產(chǎn)方的審核、制定質(zhì)量協(xié)議等控制相應(yīng)的質(zhì)量風(fēng)險。如果基因修飾系統(tǒng)發(fā)生變更，應(yīng)及時評估風(fēng)險，開展相應(yīng)的藥學(xué)可比性研究，在某些情況下可能還需要非臨床或/和臨床橋接研究。

四、風(fēng)險評估與控制

（一）整體風(fēng)險識別與控制策略

基因修飾系統(tǒng)涉及的風(fēng)險主要包括病毒載體回復(fù)突變、載體在基因組中整合致癌或致病、脫靶風(fēng)險、外源因子污染、雜質(zhì)殘留等。

藥學(xué)研究可從修飾系統(tǒng)的設(shè)計、制備工藝和質(zhì)量控制等多個方面開展風(fēng)險因素的分析，識別、確定與產(chǎn)品質(zhì)量和安全性相關(guān)的風(fēng)險因素,確定研發(fā)期間所需進(jìn)行風(fēng)險評估的數(shù)據(jù)范圍和重點，并制定風(fēng)險防控和處理措施。同時，需結(jié)合細(xì)胞類型、劑量、給藥途徑、使用人群、作用機制、體內(nèi)分布、體內(nèi)作用時間等方面綜合考慮風(fēng)險。

基因修飾系統(tǒng)設(shè)計方面，典型風(fēng)險因素可能包括：風(fēng)險元件的使用，同源序列可能導(dǎo)致的序列重組，病毒載體經(jīng)相應(yīng)野生型或輔助病毒互補后產(chǎn)生回復(fù)突變,載體在細(xì)胞中潛伏/再激活和/或動員，載體在細(xì)胞染色體整合程度和整合位點的偏好性等。制備工藝方面，相關(guān)風(fēng)險因素可能包括：高風(fēng)險原材料的使用，制備過程中外源因子的污染，中間產(chǎn)物的貯存和質(zhì)量控制，有害雜質(zhì)的引入與生成，以及修飾系統(tǒng)的基因序列穩(wěn)定性等。質(zhì)量控制方面，相關(guān)風(fēng)險因素可能包括：檢測方法的適用性、標(biāo)準(zhǔn)限度的合理性等。

近年來，基于酶的基因編輯系統(tǒng)逐漸應(yīng)用于細(xì)胞治療產(chǎn)品的基因修飾，常見的系統(tǒng)包括轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALEN）、規(guī)律性重復(fù)短回文序列簇-相關(guān)蛋白（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR associated protein，Cas）等。該類系統(tǒng)的臨床使用風(fēng)險主要包括基因工具酶的自身毒性、免疫原性、基因編輯時基因上靶、脫靶導(dǎo)致的毒性和雜質(zhì)殘留等。

因此，應(yīng)根據(jù)多方面因素，結(jié)合細(xì)胞終產(chǎn)品的特點，針對不同類型基因修飾系統(tǒng)的特性進(jìn)行風(fēng)險評估和控制。例如，根據(jù)風(fēng)險評估情況，合理設(shè)計修飾系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和序列，避免使用致癌元件等高風(fēng)險的元件，進(jìn)行相關(guān)檢測，盡可能降低同源重組和病毒載體回復(fù)突變的可能性；對高風(fēng)險的生產(chǎn)原材料進(jìn)行質(zhì)量控制，在適當(dāng)?shù)闹苽洵h(huán)節(jié)，設(shè)定過程控制的檢測項目和驗收標(biāo)準(zhǔn)；根據(jù)修飾系統(tǒng)作用機理，針對基因序列穩(wěn)定性等安全性相關(guān)的風(fēng)險因素開展研究等。在細(xì)胞終產(chǎn)品生命周期內(nèi)對修飾系統(tǒng)進(jìn)行跟蹤分析和更新，收集數(shù)據(jù)以進(jìn)一步確定其風(fēng)險特征并制定控制策略。

（二）不同生產(chǎn)使用情形的風(fēng)險

基因修飾系統(tǒng)在細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)過程中的使用情形可能不同，目前研究可能包括體外基因修飾后直接制備細(xì)胞產(chǎn)品（情形一）和體外基因修飾后建系/庫再制備細(xì)胞產(chǎn)品（情形二）兩種使用情形。兩種使用情形相應(yīng)基因修飾系統(tǒng)的風(fēng)險不同，其藥學(xué)研究的要求可能存在差異，需要具體問題具體分析。

對于情形一，基因修飾系統(tǒng)建議在 GMP 的條件下制備，該情形下所用的基因修飾系統(tǒng)與回輸人體的細(xì)胞直接接觸，應(yīng)關(guān)注該系統(tǒng)生產(chǎn)用原材料的質(zhì)量控制、批次間的質(zhì)量差異、雜質(zhì)水平等可能影響細(xì)胞治療產(chǎn)品安全性、有效性的研究內(nèi)容。本指導(dǎo)原則后文主要論述該情形。

對于情形二，基因修飾系統(tǒng)用于細(xì)胞系/庫的建立，其序列的設(shè)計、生產(chǎn)用材料、制備工藝、質(zhì)量、穩(wěn)定性、內(nèi)包材的要求可依具體情況，結(jié)合細(xì)胞系/庫的質(zhì)量研究結(jié)果進(jìn)行綜合評估。由于基因修飾系統(tǒng)使用情況的復(fù)雜性（如一次使用或多次使用），可結(jié)合生產(chǎn)使用情況和細(xì)胞系/庫的研究和檢測情況，制定修飾系統(tǒng)的風(fēng)險控制策略。良好的基因修飾系統(tǒng)質(zhì)量研究與控制有利于篩選、建立出質(zhì)量良好的細(xì)胞系/庫，有利于后續(xù)的生產(chǎn)研究。細(xì)胞系/庫建立過程中，建議進(jìn)行單克隆篩選，對細(xì)胞系/庫進(jìn)行檢定和傳代穩(wěn)定性研究，關(guān)注細(xì)胞系/庫功能是否符合理論設(shè)計和預(yù)期、安全是否可控，必要時對細(xì)胞終產(chǎn)品進(jìn)行基因修飾相應(yīng)的質(zhì)量研究，以確認(rèn)基因修飾系統(tǒng)的適用性。

（三）變更風(fēng)險

隨著基因修飾技術(shù)不斷更新和研究經(jīng)驗的逐步積累，研發(fā)過程常常伴隨基因修飾系統(tǒng)的升級和工藝的優(yōu)化，因此研發(fā)各階段基因修飾系統(tǒng)有可能發(fā)生變更。

基因修飾系統(tǒng)變更可能顯著影響細(xì)胞產(chǎn)品的安全性和有效性，是細(xì)胞治療產(chǎn)品藥學(xué)研究的重要風(fēng)險之一，研發(fā)者需評估變更引入的影響和風(fēng)險。根據(jù)風(fēng)險評估情況，對基因修飾系統(tǒng)及其細(xì)胞終產(chǎn)品（如適用）的質(zhì)量、工藝控制、穩(wěn)定性等方面進(jìn)行深入研究，合理設(shè)計變更可比性研究方案。

五、基因修飾系統(tǒng)的設(shè)計、制備和質(zhì)量控制

（一）病毒載體類基因修飾系統(tǒng)

1. 病毒載體的設(shè)計與構(gòu)建

1.1 目的基因及調(diào)控元件

目的基因是基因修飾系統(tǒng)中實現(xiàn)預(yù)期功能的關(guān)鍵序列，調(diào)控元件是影響目的基因序列轉(zhuǎn)錄、翻譯和穩(wěn)定性的重要序列。研發(fā)者應(yīng)基于細(xì)胞終產(chǎn)品的安全性和有效性，結(jié)合風(fēng)險評估，進(jìn)行基因修飾系統(tǒng)各元件的設(shè)計與構(gòu)建。

目的基因：本文中是指基因修飾系統(tǒng)傳遞、表達(dá)的遺傳物質(zhì)，研發(fā)者應(yīng)結(jié)合其在疾病治療中的作用或作用機理謹(jǐn)慎選用和設(shè)計目的基因序列，關(guān)注目的基因的來源、序列篩選及優(yōu)化過程，明確完整的核苷酸、氨基酸（如適用）序列信息，并建議與數(shù)據(jù)庫收錄的相關(guān)序列進(jìn)行序列比對。目的基因的優(yōu)化中，應(yīng)闡述分子改構(gòu)的科學(xué)評估及驗證研究考慮，如人源化改構(gòu)，敲減元件，自殺標(biāo)記，以及為調(diào)控高級結(jié)構(gòu)形成或為適應(yīng)載體大小進(jìn)行的序列改造和刪減等。同時，建議結(jié)合目的基因或其表達(dá)產(chǎn)物與靶分子的特異性結(jié)合能力，評估潛在的非特異性效應(yīng)等?？梢越Y(jié)合目的基因序列特征、目的蛋白與細(xì)胞基因組的相互作用等，充分考慮目的基因?qū)δ康募?xì)胞基因組穩(wěn)定性的影響。如目的基因?qū)儆诜侨嗽椿蚋臉?gòu)的序列等，也可結(jié)合種屬間目的基因序列差異和表達(dá)產(chǎn)物的免疫特性，評估目的基因的免疫原性。

調(diào)控元件：功能性元件對目的基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)具有重要調(diào)控作用，研發(fā)者應(yīng)關(guān)注其設(shè)計原理并進(jìn)行確認(rèn)研究?？梢愿鶕?jù)目的基因的表達(dá)量、預(yù)期作用和持續(xù)時間以及目的細(xì)胞的類型等合理選擇和設(shè)計調(diào)控元件，相關(guān)的調(diào)控元件可能包括信號肽、轉(zhuǎn)錄啟動子、增強子、終止子、隔離子、5’ 非翻譯區(qū)、3’非翻譯區(qū)、多聚腺苷酸信號區(qū)、內(nèi)含子、其他增強轉(zhuǎn)錄及翻譯效率相關(guān)元件、復(fù)制起始位點、額外引入的基因序列等。各調(diào)控元件的序列來源及選擇依據(jù)應(yīng)明確。例如啟動子設(shè)計方面，建議結(jié)合目標(biāo)細(xì)胞類型、目的基因表達(dá)時間和表達(dá)量的需求、啟動子的人用經(jīng)驗等分析其啟動子使用的安全性，在風(fēng)險評估的基礎(chǔ)上合理選用。調(diào)控元件設(shè)計時需充分考慮元件的安全性和有效性，關(guān)注相關(guān)序列引入的必要性和合理性，盡量避免使用高風(fēng)險的元件，如必需使用，應(yīng)進(jìn)行相關(guān)序列的安全性改構(gòu)。對于序列改構(gòu)或優(yōu)化的元件，均應(yīng)明確序列更改的依據(jù)與安全性考慮。此外，還建議關(guān)注功能元件設(shè)計對細(xì)胞基因組內(nèi)源性基因的干擾。

1.2 病毒載體

病毒載體通?？梢苑€(wěn)定、高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)目的基因至目的細(xì)胞中發(fā)揮作用。病毒載體的選擇和設(shè)計可綜合考慮目的基因表達(dá)時間、表達(dá)量，病毒載體的致病性、整合能力、感染過程、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、細(xì)胞毒性以及細(xì)胞產(chǎn)品的細(xì)胞類型、作用機制、臨床適應(yīng)癥、給藥方法等多方面。病毒載體的結(jié)構(gòu)優(yōu)化策略包括提高病毒穩(wěn)定性、增強細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)率、拓寬可轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞類型等。

目前常用的病毒載體通常進(jìn)行了毒力、致病性或復(fù)制能力相關(guān)基因的刪除，以確保使用的安全性。設(shè)計中，應(yīng)盡可能降低與野生型病毒相關(guān)的任何致病性，并盡可能將病毒重組和回復(fù)突變的風(fēng)險降到最低。對于改構(gòu)的病毒載體需關(guān)注親本病毒的來源、培養(yǎng)歷史和生物學(xué)特性等，對改構(gòu)用材料、方法、步驟及鑒定進(jìn)行充分研究。病毒載體進(jìn)行改構(gòu)時，不應(yīng)引入新的安全風(fēng)險。

下面以目前研究中常見的病毒載體為例進(jìn)行說明。

1.2.1 γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（γ-Retroviral Vector）

γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒可逆轉(zhuǎn)錄其 RNA 基因組成為 DNA 拷貝，病毒 DNA 隨機整合進(jìn)入有絲分裂活躍的細(xì)胞基因組。目前，體外基因修飾用 γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體常見有鼠白血病病毒（Murine Leukaemia Viruses，MuLV），貓白血病病毒（Feline Leukaemia Virus，F(xiàn)eLV）和長臂猿白血病病毒（Gibbon Ape Leukaemia Virus，GALV）等載體。其基因設(shè)計與改造主要包括提高載體安全性和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)有效性。

γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可通過轉(zhuǎn)移質(zhì)粒（含有目的基因）、輔助質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)細(xì)胞進(jìn)行病毒載體包裝，也可通過整合了轉(zhuǎn)移質(zhì)粒序列、輔助包裝元件的穩(wěn)定產(chǎn)毒細(xì)胞系制備。為提升基因修飾載體的安全性，建議對修飾系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，例如使用刪除了非必需元件、經(jīng)充分改構(gòu)、安全性級別較高的 γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，盡可能將病毒重組和回復(fù)突變的風(fēng)險降到最低。具體優(yōu)化操作還可能包括使用異源啟動子和異源 polyA 信號表達(dá)輔助包裝元件、將輔助包裝元件拆分于不同質(zhì)粒表達(dá)、改造長末端重復(fù)序列（Long terminal repeat，LTR）使得末端自失活（Self Inactivating, SIN）等方式。

基因轉(zhuǎn)導(dǎo)有效性方面，鼓勵研發(fā)者對病毒載體包裝元件進(jìn)行優(yōu)化，提高病毒載體包裝效率、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)導(dǎo)活性等，如將 γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包膜蛋白替換為其他包膜蛋白以提高病毒穩(wěn)定性等。針對改造情況，需進(jìn)行充分的研究與驗證。

1.2.2 慢病毒載體（Lentiviral Vector）

慢病毒載體通過介導(dǎo)目的基因整合至細(xì)胞基因組發(fā)揮作用，與 γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能感染有絲分裂活躍的細(xì)胞不同，慢病毒載體能感染有絲分裂活躍和不活躍的細(xì)胞。目前，體外基因修飾用慢病毒載體常見有人慢病毒、非人靈長類和非靈長類慢病毒等載體。使用非人靈長類和非靈長類慢病毒載體時建議關(guān)注產(chǎn)生重組病毒嵌合體和/或跨物種傳播的相關(guān)風(fēng)險。慢病毒載體的設(shè)計與改造主要包括提高載體安全性和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)有效性。

慢病毒載體制備和臨床使用的主要風(fēng)險點包括：產(chǎn)生復(fù)制型慢病毒（Replication-competent lentivirus，RCL），發(fā)生體內(nèi)重組，以及在相關(guān)基因中或其附近插入前病毒 DNA 從而可能引起或促進(jìn)腫瘤發(fā)生和其他細(xì)胞病變等。因此，慢病毒載體設(shè)計方面，建議采用所有可能降低慢病毒致病風(fēng)險的措施，包括不同包裝基因分離于不同質(zhì)粒表達(dá)（如 gag/pol 和 rev 分離），降低輔助質(zhì)粒和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒間的序列同源性，刪除不必要的調(diào)控元件，改造 LTR 使得末端自失活等。對于轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，鼓勵進(jìn)行序列優(yōu)化，提高安全性，如降低啟動子插入目的細(xì)胞引起原癌基因活化的幾率等。

為了提高基因轉(zhuǎn)導(dǎo)有效性，可考慮采用替換包膜蛋白、提升定點整合能力等改造策略。例如，人類免疫缺陷病毒（HIV）衍生的慢病毒載體，可通過用編碼異源病毒包膜蛋白（如 VSV-G）的基因替換 HIV 包膜蛋白基因序列來制備以增強載體的親嗜性和穩(wěn)定性。通過對整合酶和 LTR 等序列進(jìn)行改造，提升慢病毒載體的定點整合性能。對載體改造的同時，建議關(guān)注病毒載體穩(wěn)定性的變化、整合位點的偏好性等可能引入的風(fēng)險。

1.2.3 仙臺病毒載體（Sendai Viral Vector）

仙臺病毒載體是在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)目的基因，通常不整合于細(xì)胞基因組中的單鏈反義 RNA 病毒載體。目前有研究將其應(yīng)用于細(xì)胞重編程建立誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系（iPSC）的過程中。設(shè)計和構(gòu)建時，在穩(wěn)定表達(dá)目的基因的同時，為防止產(chǎn)生具有復(fù)制能力的病毒顆粒，可考慮刪除或改構(gòu)病毒組裝相關(guān)蛋白，例如參與病毒組裝的核衣殼結(jié)構(gòu)蛋白以及基質(zhì)蛋白等。為確保有效地控制 iPSC 中仙臺病毒載體的殘留量，可以考慮改構(gòu)復(fù)制相關(guān)元件，例如通過 RNA 聚合酶的突變等方式，構(gòu)建具有溫度依賴型復(fù)制能力的仙臺病毒載體；同時，需建立相關(guān)方法檢測和驗證仙臺病毒載體在 iPSC 克隆中是否殘留以控制風(fēng)險。

其他病毒載體還可能包括腺病毒、腺相關(guān)病毒等載體，其分子設(shè)計和構(gòu)建可以結(jié)合特定病毒結(jié)構(gòu)、目的基因序列特征、包裝序列的安全性等綜合考慮?；驹瓌t可參考上述內(nèi)容。

2. 生產(chǎn)用物料

2.1 質(zhì)粒

對于采用多個質(zhì)粒瞬時共轉(zhuǎn)染方式制備的病毒載體，需根據(jù)風(fēng)險、結(jié)合載體特性等，開展相應(yīng)的質(zhì)粒設(shè)計構(gòu)建、生產(chǎn)工藝、質(zhì)量控制和穩(wěn)定性等研究。

設(shè)計和構(gòu)建：根據(jù)研究，選擇合理的質(zhì)粒骨架、質(zhì)粒復(fù)制起始點、啟動子以及選擇性標(biāo)記等組成元件，刪除非必需元件（特別是致癌等風(fēng)險較高的序列），并完整確認(rèn)質(zhì)粒的核苷酸序列。質(zhì)粒構(gòu)建時一般應(yīng)避免使用 β-內(nèi)酰胺類抗生素抗性基因，且質(zhì)粒設(shè)計時建議最大程度防止抗性基因序列插入病毒載體基因組中，鼓勵開發(fā)研究采用非抗性基因篩選的質(zhì)粒。采用額外的增強轉(zhuǎn)錄或翻譯的元件時，應(yīng)充分評估其功能性和安全性，在必要時，進(jìn)行相應(yīng)的安全性改造，如土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件（Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element, WPRE）等。建議盡可能將不同包裝元件拆分于多個質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)，以降低同源重組發(fā)生的概率。

生產(chǎn)工藝：根據(jù)工藝研究情況，通過對關(guān)鍵工藝參數(shù)的探索和優(yōu)化，確定穩(wěn)定的質(zhì)粒規(guī)?；a(chǎn)工藝，生產(chǎn)工藝應(yīng)有明確的生產(chǎn)規(guī)模、工藝流程、工藝步驟的詳細(xì)描述以及過程控制策略等。質(zhì)粒生產(chǎn)過程中應(yīng)盡量避免使用人源和動物源性材料，避免使用 β-內(nèi)酰胺類抗生素，如需使用其他種類的抗生素，應(yīng)對抗生素的殘留量進(jìn)行控制和安全性評估?；谘邪l(fā)階段和風(fēng)險評估，開展質(zhì)粒工藝驗證或確認(rèn)研究，如工藝過程控制確認(rèn)、中間產(chǎn)物貯存穩(wěn)定性研究、多批次質(zhì)量分析以及雜質(zhì)清除研究等。

質(zhì)量控制：需建立合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并進(jìn)行放行檢驗。質(zhì)粒放行的質(zhì)控項目一般包括：pH 值、外觀、鑒別（限制性內(nèi)切酶分析和測序）、質(zhì)粒濃度 /含量、純度與雜質(zhì)（A260/A280、超螺旋比例、宿主菌 DNA 殘留、宿主菌 RNA 殘留、宿主蛋白殘留、抗生素殘留（如適用））、無菌及細(xì)菌內(nèi)毒素等。

穩(wěn)定性研究：選擇合理、敏感的考察項目（如超螺旋比例等）進(jìn)行穩(wěn)定性監(jiān)測，根據(jù)研究結(jié)果制定合理的貯存條件和有效期。

2.2 細(xì)菌種子批

本指導(dǎo)原則細(xì)菌種子批指通過將病毒包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌，經(jīng)單克隆篩選及培養(yǎng)傳代后建立的種子庫。對于選用的宿主菌，需充分考慮宿主菌的來源、基因型、表型、既往使用經(jīng)驗和生產(chǎn)需求等因素，如使用新型菌株，需關(guān)注其可能引入的額外風(fēng)險。

細(xì)菌種子批的建立：根據(jù)研究建立各級細(xì)菌種子批，明確制備規(guī)模、擴(kuò)增條件、貯存條件等。研究中關(guān)注目標(biāo)克隆篩選的情況，關(guān)注用于生成種子批的材料的來源、生產(chǎn)過程等以評估分析安全性風(fēng)險。

細(xì)菌種子批的質(zhì)量控制：建立適宜的放行檢測項目、標(biāo)準(zhǔn)和檢測方法。檢測項目一般包括細(xì)菌形態(tài)學(xué)鑒別、染色鏡檢、生化特性分析、抗性檢查、質(zhì)粒限制酶切圖譜分析、目的基因和其他元件序列準(zhǔn)確性分析等。檢測方法需經(jīng)過研究確認(rèn)和/或驗證。通過質(zhì)量控制應(yīng)確保不存在其它細(xì)菌、真菌和噬菌體的污染，以及確保目的基因序列和其他元件序列的準(zhǔn)確性。

細(xì)菌種子批穩(wěn)定性研究：傳代穩(wěn)定性一般包括質(zhì)粒大小、質(zhì)粒序列準(zhǔn)確性、質(zhì)粒限制酶切圖譜、質(zhì)粒保有率、質(zhì)粒拷貝數(shù)等，根據(jù)研究結(jié)果明確種子批的限定傳代代次。貯存穩(wěn)定性建議關(guān)注在貯存條件下和時長內(nèi)種子批的活率等。

2.3 生產(chǎn)/包裝細(xì)胞庫

病毒載體制備涉及的細(xì)胞基質(zhì)包括包裝病毒載體用細(xì)胞基質(zhì)和可以穩(wěn)定產(chǎn)生病毒載體的細(xì)胞基質(zhì)。選擇細(xì)胞基質(zhì)時，需要考慮病毒載體包裝和制備的可行性，結(jié)合細(xì)胞來源（包括物種來源）、生長特性和載體制備能力，以及可能影響最終產(chǎn)品安全性的細(xì)胞特征等，選擇適合的細(xì)胞基質(zhì)。風(fēng)險評估時，要充分考慮細(xì)胞基質(zhì)中是否存在內(nèi)源性病毒顆粒、致癌序列等。對于新建立的細(xì)胞基質(zhì)或具有相應(yīng)風(fēng)險的細(xì)胞基質(zhì)（如腫瘤細(xì)胞來源的細(xì)胞），適用的情況下應(yīng)評估細(xì)胞的成瘤性和致瘤性。有些情況下，需要對細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行修飾（例如插入特定病毒蛋白表達(dá)序列允許病毒復(fù)制或包裝），研究中應(yīng)該關(guān)注修飾后細(xì)胞的遺傳、表觀和生長等特性以及病毒載體制備情況等。細(xì)胞基質(zhì)選定和/或修飾后需建立細(xì)胞庫，以確保生產(chǎn)的穩(wěn)定性和一致性?？蓞⒄铡吨袊幍洹?、 ICH Q5A、ICH Q5D 等相關(guān)要求對細(xì)胞庫進(jìn)行檢定。檢測項目需根據(jù)風(fēng)險評估確定，至少包括鑒別、無菌、支原體、螺原體（昆蟲細(xì)胞）以及內(nèi)、外源病毒因子、種屬特異性病毒等。開展細(xì)胞庫傳代穩(wěn)定性研究，包括細(xì)胞生長穩(wěn)定性、遺傳穩(wěn)定性、病毒載體包裝能力穩(wěn)定性等，建議研究中納入病毒載體的生產(chǎn)終末細(xì)胞或平行生產(chǎn)的對照細(xì)胞，擬定適合病毒載體制備的細(xì)胞限傳代次。

包裝病毒載體用細(xì)胞庫：細(xì)胞庫細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)增、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后合成病毒載體基因序列、表達(dá)載體蛋白，并最終形成病毒載體顆粒。例如，目前慢病毒載體包裝常見使用 HEK293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)入該細(xì)胞的質(zhì)粒 LTR 之間的 DNA 片段被轉(zhuǎn)錄成RNA，由輔助質(zhì)粒表達(dá)的蛋白將其包裝形成病毒載體顆粒。需要關(guān)注的是，當(dāng)病毒載體與非載體 DNA 序列（如質(zhì)粒 DNA、輔助病毒序列、細(xì)胞 DNA 等）共同包裝時，非載體 DNA 序列可能與病毒載體同源重組，或其殘留可能產(chǎn)生致癌風(fēng)險，建議開展風(fēng)險分析與研究，評估細(xì)胞基質(zhì)選用的合理性。例如使用含有腺病毒 E1、SV40LT 抗原等風(fēng)險元件的細(xì)胞基質(zhì)包裝慢病毒載體時，應(yīng)關(guān)注載體中腺病毒 E1 和SV40LT 抗原序列的殘留量。

可以穩(wěn)定產(chǎn)生病毒載體的細(xì)胞庫：細(xì)胞基質(zhì)經(jīng)基因修飾、篩選、建庫后可穩(wěn)定表達(dá)或產(chǎn)生病毒包裝用蛋白或元件，完成病毒包裝和制備。例如，γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體制備常見使用小鼠 PG13、HEK293-Phoenix 細(xì)胞等，生產(chǎn)用細(xì)胞需穩(wěn)定表達(dá) gag-pol、包膜蛋白、目的基因等。構(gòu)建過程中建議關(guān)注其病毒包裝效率和所產(chǎn)病毒載體的質(zhì)量，并降低內(nèi)、外源因子污染和復(fù)制型病毒產(chǎn)生等安全性風(fēng)險。穩(wěn)定產(chǎn)毒細(xì)胞系需經(jīng)過基因修飾并通過單克隆篩選獲得，獲得的單克隆細(xì)胞系需建立細(xì)胞庫，并進(jìn)行全面的檢定。同時，開展細(xì)胞傳代穩(wěn)定性研究，關(guān)注不同代次穩(wěn)定產(chǎn)毒細(xì)胞中插入基因片段的遺傳穩(wěn)定性以及病毒載體的產(chǎn)量和質(zhì)量等。

2.4 病毒種子批

通過病毒種子制備病毒載體或者輔助病毒的，需建立病毒種子批。病毒種子的來源、歷史培養(yǎng)情況等需清晰明確，且風(fēng)險可控。對于培養(yǎng)歷史不清晰，存在其他病毒污染風(fēng)險，或毒株單克隆性無法確認(rèn)的病毒種子，不建議使用，如確需使用，可以在構(gòu)建過程中進(jìn)行多輪噬斑純化、有限稀釋純化或通過 DNA/RNA 克隆拯救等，以確保毒株的純度和單克隆性。

種子批的建立過程、代次、貯存和維護(hù)等信息應(yīng)清晰、明確；如有，應(yīng)說明種子批制備過程使用的人源/動物源材料，并進(jìn)行安全性評估。

病毒種子批應(yīng)經(jīng)過充分檢測，檢測項目建議包括：無菌、支原體以及外源病毒因子、病毒載體和目的基因的鑒別與測序、病毒滴度或濃度、生物學(xué)活性、雜質(zhì)、對抗病毒藥物的敏感性（如適用）、回復(fù)突變（如適用）等。建議對病毒種子批進(jìn)行全基因測序，并對測序結(jié)果與預(yù)期序列進(jìn)行對比分析，如有，需對所有差異進(jìn)行評估。對于序列較長的病毒載體，建議最大程度進(jìn)行序列分析，所分析的序列建議包括基因插入片段、側(cè)翼區(qū)域以及載體中被修飾或可能易于重組的區(qū)域。

病毒種子批需開展全面的傳代穩(wěn)定性研究，研究過程應(yīng)能代表或模擬實際制備工藝，研究中關(guān)注病毒種子批的遺傳穩(wěn)定性和生產(chǎn)穩(wěn)定性等。根據(jù)研究，制定病毒種子批的限定傳代代次。

如病毒載體制備過程使用了輔助病毒，應(yīng)開展充分的研究說明輔助病毒使用的必要性和選擇依據(jù)，結(jié)合科學(xué)認(rèn)知及生產(chǎn)經(jīng)驗說明輔助病毒的安全性。輔助病毒的設(shè)計構(gòu)建、建庫、生產(chǎn)制備和檢定建議參考上述病毒種子批的一般要求。

2.5 其他生產(chǎn)用物料

其他生產(chǎn)用物料包括原材料（如試劑、培養(yǎng)基等）、耗材、培養(yǎng)容器等。結(jié)合工藝研究，選用適宜的生產(chǎn)用原材料，制定合理的原材料質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行嚴(yán)格的供應(yīng)商審計，明確生產(chǎn)用原材料的來源、組分、功能、使用階段、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等。制備過程中盡量避免使用人或動物來源的成分，如果確需使用，可參考《中國藥典》相關(guān)規(guī)定和/或 ICH Q5A 等指南開展外源因子等安全性相關(guān)的風(fēng)險評估與研究。需要重點關(guān)注的原材料包括：用于細(xì)胞培養(yǎng)的人或動物源材料（如牛血清、消化酶），質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑（如聚乙烯亞胺、陽離子脂質(zhì)等），核酸酶等。對于病毒載體制備或貯存時使用的人血白蛋白等風(fēng)險較高的制品，建議盡可能選用經(jīng)監(jiān)管部門批準(zhǔn)，并符合國家相關(guān)技術(shù)要求和管理規(guī)范的產(chǎn)品。對于耗材和培養(yǎng)容器，建議經(jīng)過分析和研究，評估其適用性，盡量降低病毒載體制備過程中的安全性風(fēng)險。

3. 制備工藝

病毒載體的制備工藝是指從生產(chǎn)用細(xì)胞的復(fù)蘇擴(kuò)增、病毒載體的收獲到病毒載體灌裝、貯存（如有）的全過程。對于體外基因修飾后直接制備細(xì)胞產(chǎn)品的病毒載體系統(tǒng)，由于病毒載體質(zhì)量可直接影響終產(chǎn)品質(zhì)量，因此其制備工藝研究應(yīng)更加充分完善。在對整體工藝的充分理解和對病毒載體質(zhì)量的累積經(jīng)驗基礎(chǔ)上制定制備工藝，建立規(guī)范的工藝操作步驟、工藝控制參數(shù)和廢棄標(biāo)準(zhǔn)，并明確關(guān)鍵工藝參數(shù)。制備工藝應(yīng)適用于確保細(xì)胞產(chǎn)品符合對應(yīng)開發(fā)階段的質(zhì)量目標(biāo)產(chǎn)品概況的要求。另外，還應(yīng)采取措施避免病毒載體在制備、貯存、運輸?shù)恼麄€過程中發(fā)生混淆、污染與交叉污染等。

3.1 制備規(guī)模和批次定義

不同類型病毒載體的生產(chǎn)用細(xì)胞類型、生長特性、病毒載體產(chǎn)量和穩(wěn)定性等存在較大差異，制備工藝成熟程度及病毒載體使用量等也不盡相同，建議結(jié)合待基因修飾細(xì)胞的特性、病毒載體的工藝和臨床使用需求等，合理確定病毒載體的制備規(guī)模。病毒載體制備規(guī)模需與細(xì)胞終產(chǎn)品研究階段（臨床試驗、商業(yè)化制備）相適應(yīng)。工藝中可能包括生產(chǎn)用細(xì)胞培養(yǎng)、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或病毒感染、收獲、純化等步驟，制備過程中的上、下游工藝規(guī)模需盡量匹配且合理。對于較小的規(guī)模，建議關(guān)注不同批次間的質(zhì)量一致性。

根據(jù)病毒載體工藝特點，制定批次定義和編號規(guī)則。如有需要，可明確制備過程中不同工藝步驟，特別關(guān)注如有分批和合批的操作步驟時的批次定義和編號規(guī)則。確保病毒載體批次的可追溯性。

3.2 工藝研究與開發(fā)

    用于制備病毒載體的工藝有多種，包括通過質(zhì)粒 DNA瞬時轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞基質(zhì)制備，通過穩(wěn)定的生產(chǎn)用細(xì)胞系制備，或通過病毒種子感染細(xì)胞基質(zhì)制備。

鼓勵結(jié)合質(zhì)量源于設(shè)計和全過程控制等新理念，以及對相關(guān)風(fēng)險控制的一般要求開展工藝研究。隨著生產(chǎn)經(jīng)驗的積累和質(zhì)量屬性認(rèn)識的加深，不斷優(yōu)化工藝，最終完成實驗室工藝到商業(yè)化規(guī)模工藝的轉(zhuǎn)化。制備工藝一般可以分為上游、下游兩個階段，即上游病毒載體收獲階段和下游病毒載體純化階段。制備過程中的生產(chǎn)用細(xì)胞種類、細(xì)胞培養(yǎng)條件、轉(zhuǎn)染或感染條件、收獲時間、純化步驟及貯存條件等均會影響病毒載體的包裝效率和質(zhì)量。研究中需對工藝步驟、關(guān)鍵工藝參數(shù)及其控制范圍進(jìn)行研究、確認(rèn)或驗證，并建立相應(yīng)的過程控制標(biāo)準(zhǔn)。例如，復(fù)制型病毒（Replication competent virus, RCV）是過程控制中的安全性風(fēng)險關(guān)注點之一，應(yīng)根據(jù)病毒載體種類、工藝特點等開展風(fēng)險評估，在制備過程中選擇合理的檢測點（如病毒載體收獲液、生產(chǎn)終末期細(xì)胞或純化后的病毒載體原液等），采用經(jīng)驗證的方法開展檢測。另外，基于風(fēng)險，結(jié)合病毒對于理化條件的耐受性，必要時，還需根據(jù)生產(chǎn)用細(xì)胞類型、輔助病毒使用、純化工藝特點等建立相應(yīng)的病毒去除/滅活步驟并進(jìn)行充分的驗證。

下文以 γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體為例分別對穩(wěn)定產(chǎn)毒和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兩種制備工藝進(jìn)行介紹。其他病毒載體和其他制備方式，如適用，也可參考。

3.2.1 穩(wěn)定產(chǎn)毒制備工藝研究

（1）制備

    以 γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體為例，制備時其由穩(wěn)定產(chǎn)毒細(xì)胞分泌至培養(yǎng)液中，可經(jīng)過澄清過濾等步驟純化獲得病毒載體。建議根據(jù)病毒載體的結(jié)構(gòu)特性、包裝機制、穩(wěn)定性等制定合理的工藝步驟和參數(shù)，關(guān)注制備過程中的細(xì)胞培養(yǎng)體積、接種密度、培養(yǎng)條件、收獲時間等。例如，有報道稱由于γ逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的一些包膜蛋白在通常細(xì)胞培養(yǎng)條件（37℃）下的穩(wěn)定性較弱，針對該情況建議開展研究，制定相應(yīng)的病毒制備和收獲策略，以確保病毒載體的活性和回收率。

    （2）純化

根據(jù) γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的結(jié)構(gòu)特點、宿主細(xì)胞的種類、雜質(zhì)殘留的成分等,設(shè)計合理的純化工藝，以提高病毒載體的純度，降低雜質(zhì)殘留的安全性風(fēng)險。

例如，某些病毒載體的包膜蛋白可能對層析工藝比較敏感（如剪切力），因此，鼓勵開發(fā)先進(jìn)的純化工藝，在滿足病毒載體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能活性的基礎(chǔ)上，盡可能提高病毒載體的純度，實現(xiàn)病毒載體的規(guī)?；兓?。

3.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染制備工藝研究

（1）包裝與制備

以慢病毒載體為例，用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的病毒包裝細(xì)胞通常采用貼壁或懸浮方式培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)方式建議根據(jù)規(guī)模、制備工藝設(shè)計和質(zhì)量研究等選擇以滿足商業(yè)化制備的需求。病毒包裝工藝的研究包括對質(zhì)粒濃度、質(zhì)粒比例、轉(zhuǎn)染試劑及濃度、誘導(dǎo)試劑濃度（如有）、轉(zhuǎn)染時間、細(xì)胞密度、細(xì)胞培養(yǎng)基組分、細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境（溫度、pH、溶氧）、收獲時間、收獲次數(shù)等參數(shù)的優(yōu)化。根據(jù)研究，確認(rèn)工藝步驟、關(guān)鍵工藝參數(shù)及其控制范圍，并建立相應(yīng)的過程控制標(biāo)準(zhǔn)。例如在細(xì)胞培養(yǎng)過程中定期檢測細(xì)胞活率和生物負(fù)荷，開展載體滴度、支原體和外源性病毒等檢測，并進(jìn)行復(fù)制型慢病毒（RCL）檢測等。載體收獲液如需貯存，需開展相應(yīng)的研究以確認(rèn)貯存條件、貯存方式等。對于外源因子檢測，建議盡量提高檢測方法的靈敏度，在適宜的檢測點（如外源因子富集的階段）進(jìn)行檢測。

（2）純化

目前，慢病毒載體的純化工藝通常采用核酸內(nèi)切酶去除附在病毒載體表面的大片段核酸雜質(zhì)，經(jīng)澄清、過濾及離子層析或分子排阻色譜等純化步驟進(jìn)行雜質(zhì)的去除，最后經(jīng)制劑、除菌過濾、灌裝制成病毒載體以備使用。根據(jù)研究，純化工藝可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整和優(yōu)化，研究確定各純化工藝步驟以達(dá)到去除雜質(zhì)，純化病毒的目的。如適用，工藝研究中建議對核酸酶濃度、純化方式、介質(zhì)選擇、動態(tài)載量、流速、回收率、病毒載體貯存條件、灌裝工藝參數(shù)等進(jìn)行研究，并對核酸酶殘留、BSA 殘留、風(fēng)險元件殘留（如腺病毒 E1 和SV40LT 抗原序列殘留）、質(zhì)粒 DNA 殘留、宿主蛋白殘留、宿主 DNA 殘留及轉(zhuǎn)染試劑殘留等雜質(zhì)的去除率進(jìn)行研究。純化工藝過程中需加強過程控制檢測或質(zhì)量研究，如生物負(fù)荷、內(nèi)毒素、物理滴度、轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度等。

3.3 工藝驗證

制備工藝鎖定后需開展工藝驗證以對各步驟的工藝進(jìn)行確認(rèn)，如適用，可以包括細(xì)胞擴(kuò)增和載體制備各個步驟的驗證、中間產(chǎn)物貯存條件和時間驗證、雜質(zhì)清除驗證、培養(yǎng)基模擬灌裝驗證、層析柱和超濾膜循環(huán)使用次數(shù)和除菌濾器的驗證以及運輸驗證等。通過工藝驗證證明制備工藝及其在設(shè)定的工藝參數(shù)范圍內(nèi)可持續(xù)、穩(wěn)定的開展生產(chǎn)，病毒載體的產(chǎn)量和回收率應(yīng)相對穩(wěn)定，對殘留的核酸酶、宿主細(xì)胞蛋白、宿主細(xì)胞 DNA、質(zhì)粒 DNA、細(xì)胞碎片、轉(zhuǎn)染試劑等雜質(zhì)，應(yīng)有效清除至低于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)范圍或經(jīng)過驗證研究的水平。

鼓勵建立上、下游規(guī)模匹配的制備工藝，如果在制備過程中出現(xiàn)合批和/或分批的情況，需結(jié)合實際制備情況進(jìn)行充分的研究驗證，根據(jù)研究結(jié)果制定合批和/或分批的原則及具體操作規(guī)范。用于合批的樣品在合批前應(yīng)經(jīng)過檢驗確認(rèn)為合格樣品。

4. 質(zhì)量研究與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

4.1質(zhì)量研究

鼓勵運用先進(jìn)的分析方法，多角度、多層面地開展質(zhì)量研究。分析方法需經(jīng)過研究和確認(rèn)，確保結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠。

一般建議采用多個代表性批次開展質(zhì)量研究，常見的研究項目包括外觀、病毒載體形態(tài)、鑒別、整合特征（如適用）、病毒載體滴度、生物學(xué)活性、純度、雜質(zhì)（如復(fù)制型病毒、風(fēng)險元件殘留、外源因子）等。根據(jù)研究結(jié)果，確定關(guān)鍵質(zhì)量屬性。

4.1.1 鑒別與序列確認(rèn)

可從病毒載體的整體水平、蛋白水平和核酸水平進(jìn)行檢測。整體水平方面，可采用電子顯微鏡觀察、免疫血清學(xué)等方法分析鑒別。蛋白水平方面，可采用蛋白質(zhì)電泳、免疫印跡等分析方法對載體的結(jié)構(gòu)蛋白、表達(dá)產(chǎn)物、蛋白表達(dá)譜、免疫標(biāo)記、表型特征等開展分析。核酸水平方面，建議對病毒載體進(jìn)行全基因組測序以確認(rèn)序列。需特別關(guān)注目的基因及調(diào)控元件序列的完整分析，對比分析測定序列與預(yù)期序列的一致性。對于整合型病毒載體，也可將病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)目的細(xì)胞后，對整合有載體序列的細(xì)胞基因組進(jìn)行測序，驗證載體骨架及目的基因序列的準(zhǔn)確性。另外，還可采用限制性酶切圖譜分析、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction， PCR）等方法對病毒載體和目的基因進(jìn)行鑒別。鑒別試驗應(yīng)設(shè)置合適的陽性和陰性對照。

4.1.2 整合特征

對于整合型病毒載體，建議選用適用的方法，研究載體整合至目的細(xì)胞基因組的典型特征，包括優(yōu)勢插入位點、插入拷貝數(shù)、優(yōu)勢克隆異常生長等。關(guān)注是否存在病毒載體優(yōu)先整合至目的細(xì)胞基因組癌基因附近的情況及其他潛在的致癌風(fēng)險。

4.1.3 病毒載體滴度

滴度是病毒載體生物學(xué)活性和含量的重要檢測項目，可用于工藝過程監(jiān)控和放行檢測，需選擇靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度等符合要求的檢測方法開展研究。鼓勵采用多種方法進(jìn)行滴度的檢測，并探索不同方法檢測數(shù)值的相關(guān)性。滴度檢測包括物理滴度（病毒載體總顆粒數(shù)）和轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度（病毒載體感染性顆粒數(shù)）。研究中需使用標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌穪硇?zhǔn)滴度檢測結(jié)果?？梢酝ㄟ^病毒載體中感染性顆粒與總顆粒的比例，用于比較不同批次之間和載體制備的不同階段之間的質(zhì)量特征。

物理滴度：載體特定蛋白/核酸的定量可用于載體顆粒數(shù)量（物理滴度）的估計。例如，HIV-1 衍生的慢病毒載體，常用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測載體樣本中的 p24 蛋白從而進(jìn)行物理滴度的檢測，檢測結(jié)果可以 p24 蛋白含量 /ml 或顆粒數(shù)/ml 表示，檢測時應(yīng)關(guān)注游離 p24 蛋白對結(jié)果的影響。此外，載體基因組拷貝數(shù)的定量也可用于物理滴度的估計，檢測時建議關(guān)注外源 DNA 的干擾。若采用新技術(shù)檢測，如病毒計數(shù)儀法、納米顆粒跟蹤分析法、場流分離多角度激光光散射法等，建議關(guān)注方法對待測病毒載體類型的適用性。

轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度：可使用基于細(xì)胞的體外檢測方法檢測病毒載體的感染能力。通常待測病毒載體感染細(xì)胞一定時間后，通過細(xì)胞基因組定量 PCR、流式細(xì)胞術(shù)、組織/細(xì)胞病變或形成噬斑等方法檢測，計算出病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度，檢測結(jié)果通常以轉(zhuǎn)導(dǎo)單位（TU/ml）、半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID₅₀）或噬斑形成單位（PFU）等表示。

4.1.4 生物學(xué)活性

一般指將目的基因轉(zhuǎn)移到目的細(xì)胞的能力以及目的基因表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)效應(yīng)，其中基因轉(zhuǎn)移能力也與病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度相關(guān)。生物學(xué)活性研究貫穿在整體研究開發(fā)過程中，建議在研發(fā)早期建立生物學(xué)活性檢測方法；上市階段，建議根據(jù)載體的作用機制和質(zhì)量屬性，盡可能確定與實現(xiàn)預(yù)期功能（替代、補償、阻斷、修正特定基因作用等）相關(guān)的生物學(xué)活性檢測方法，必要時，建立合適的標(biāo)準(zhǔn)品。由于病毒載體的生物學(xué)活性發(fā)揮可能在細(xì)胞終產(chǎn)品中體現(xiàn)，因此，也可以結(jié)合終產(chǎn)品的生物學(xué)活性綜合評價病毒載體的生物學(xué)活性。

4.1.5 純度和雜質(zhì)

（1）載體相關(guān)雜質(zhì)：與病毒載體相關(guān)的典型雜質(zhì)可能包括錯誤包裝顆粒、缺陷干擾顆粒、非感染性顆粒、空衣殼顆粒、聚集體或復(fù)制型病毒等，建議采用適用的方法，例如高效液相色譜、電泳法、毛細(xì)管電泳法、紫外吸收光譜法等進(jìn)行研究。通過病毒載體中總顆粒與感染性顆粒的比例，也可以反映病毒載體的純度和雜質(zhì)情況。另外，在核酸水平，可以考慮鑒定具有缺失、重排、雜交或突變序列的載體等相關(guān)雜質(zhì)，以含量比率的形式報告檢測數(shù)值，必要時應(yīng)納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

（2）復(fù)制型病毒的檢測：采用復(fù)制缺陷型或條件復(fù)制型病毒載體時，需在工藝的適當(dāng)階段檢測制備過程中可能產(chǎn)生的具有復(fù)制能力的病毒，并根據(jù)細(xì)胞終產(chǎn)品給藥劑量、病毒載體風(fēng)險等確定殘留量的標(biāo)準(zhǔn)限度。復(fù)制型病毒與產(chǎn)品的安全性相關(guān)，需參考相關(guān)研究經(jīng)驗或文獻(xiàn)，研究并建立靈敏的檢測方法。常見的檢測方法包括指示細(xì)胞培養(yǎng)法、直接 qPCR 法等。待測樣品包括病毒載體制備過程中收獲的病毒載體收獲液、生產(chǎn)終末細(xì)胞和細(xì)胞終產(chǎn)品等。方法開發(fā)時，需關(guān)注各檢測方法對應(yīng)的操作流程、樣本量、陰性對照、陽性對照、檢測標(biāo)志物、檢測限、判定標(biāo)準(zhǔn)等方面的設(shè)定和驗證研究。建議根據(jù)所用病毒包裝系統(tǒng)設(shè)計特異的檢測標(biāo)志物，如適用，研究中鼓勵同時采取兩種以上基于不同原理或針對不同標(biāo)志物的檢測方法，從而提高復(fù)制型病毒的檢出率。當(dāng)采用指示細(xì)胞培養(yǎng)法時，需選擇合理的擴(kuò)增細(xì)胞和指示細(xì)胞，并應(yīng)考慮待檢樣本對指示細(xì)胞生長的抑制作用等，研究、設(shè)置合理的待測樣本滴度范圍，并建議設(shè)置干擾組對照。

復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒（RCR）檢測：根據(jù)目前的研究技術(shù)水平，建議采用敏感的指示細(xì)胞培養(yǎng)法對γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行 RCR 檢測。RCR 擴(kuò)增細(xì)胞與待測樣本進(jìn)行共培養(yǎng)以最大程度擴(kuò)增 RCR，在一定傳代次數(shù)和時間的傳代培養(yǎng)后取適量上清接種 RCR 指示細(xì)胞培養(yǎng)，以觀察、計數(shù)細(xì)胞病變集落或者進(jìn)行 RCR 標(biāo)志物的檢測。

復(fù)制型慢病毒（RCL）檢測：根據(jù)目前的研究技術(shù)水平，建議采用指示細(xì)胞培養(yǎng)法對慢病毒載體進(jìn)行 RCL 檢測。對于 HIV 衍生的慢病毒載體，其 RCL 檢測所用陽性對照可考慮使用滿足檢測要求的 HIV 病毒，如缺乏輔助基因的，同時具有復(fù)制能力的病毒，研究并評估陽性對照病毒的結(jié)構(gòu)和制備方法，并在符合要求的環(huán)境中妥善操作和使用。RCL 檢測指標(biāo)方面，通常認(rèn)為 p24 蛋白、逆轉(zhuǎn)錄酶活性、psi-gag 和 VSV-G 序列等的檢出可反映 RCL 的存在，結(jié)合病毒載體具體情況和研究情況，選擇合適的檢測指標(biāo)。

    （3）工藝相關(guān)雜質(zhì)：可能包括殘留宿主細(xì)胞蛋白、非目的核酸序列、輔助病毒污染物（如傳染性病毒、病毒 DNA、病毒蛋白等）和工藝中所使用的試劑殘留，例如細(xì)胞因子、生長因子、抗體、轉(zhuǎn)染試劑、磁珠、核酸酶、血清和溶劑等。

以非目的 DNA 殘留為例，其可能包括與病毒載體共純化的殘留宿主 DNA、質(zhì)粒 DNA 等，是常見的工藝相關(guān)雜質(zhì)。包裝過程中病毒載體的衣殼內(nèi)部也可能共包裝非目的 DNA，這些雜質(zhì)可能對產(chǎn)品質(zhì)量和安全性產(chǎn)生不利影響，建議優(yōu)化工藝，以減少其污染。必要時，對殘留的非目的 DNA 序列進(jìn)行確認(rèn)和含量的監(jiān)測。當(dāng)生產(chǎn)/包裝細(xì)胞為腫瘤來源的細(xì)胞、致瘤細(xì)胞系或攜帶有致癌基因序列等需要高度關(guān)注的細(xì)胞時，在優(yōu)化工藝、降低其殘留的基礎(chǔ)上，還建議控制非目的 DNA 片段大?。ńㄗh在 200bp 以下），并對已知的高風(fēng)險基因進(jìn)行專項監(jiān)測。例如，采用 HEK293T 細(xì)胞進(jìn)行慢病毒載體制備時，需采用具有足夠的靈敏度和特異性的方法檢測腺病毒 E1 和 SV40LT 抗原序列的殘留。

4.1.6 其他

微生物污染物：檢測可能引入的污染物，包括外源病毒、細(xì)菌、真菌、支原體、細(xì)菌內(nèi)毒素等。

理化檢測：常規(guī)的理化檢測項目可能包括外觀（顏色、透明度）、可見異物、不溶性微粒、pH、含量、滲透壓等。

4.2 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是質(zhì)量控制的重要部分，包括檢測項目、檢測用方法學(xué)和各檢測指標(biāo)的可接受標(biāo)準(zhǔn)。檢測階段一般包括放行檢測和/或過程控制等。

根據(jù)現(xiàn)有研究認(rèn)知，病毒載體的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測項目通常包括外觀、鑒別、純度、含量/滴度、生物學(xué)活性、雜質(zhì)、無菌性、細(xì)菌內(nèi)毒素、支原體和外源病毒因子等。檢測用方法需經(jīng)過研究與驗證以確保檢測結(jié)果可靠和準(zhǔn)確。如適用，盡量建立對照品/標(biāo)準(zhǔn)品，并對其開展相應(yīng)的質(zhì)量研究、含量/活性的標(biāo)定、確定貯存條件等。一般情況下，可接受標(biāo)準(zhǔn)的制定依據(jù)包括產(chǎn)品質(zhì)量設(shè)計、質(zhì)量研究、工藝開發(fā)、驗證研究、方法學(xué)研究與驗證、多批檢測和穩(wěn)定性結(jié)果，以及合理的統(tǒng)計學(xué)方法等。

（二）非病毒載體類基因修飾系統(tǒng)

非病毒載體類基因修飾系統(tǒng)可通過物理、化學(xué)或生物轉(zhuǎn)導(dǎo)方式遞送進(jìn)入細(xì)胞。進(jìn)入目的細(xì)胞后，通過轉(zhuǎn)錄、剪切、翻譯等方式發(fā)揮作用，其活性組分為DNA、RNA或蛋白質(zhì)，也可能為核酸與蛋白質(zhì)組分的組合。

1. 分子設(shè)計

非病毒載體類基因修飾系統(tǒng)的設(shè)計影響目的基因修飾或目的基因表達(dá)的特異性、準(zhǔn)確性和有效性，也影響基因修飾細(xì)胞終產(chǎn)品的安全性和有效性，構(gòu)建時需要對設(shè)計和改構(gòu)的利弊進(jìn)行權(quán)衡分析。

對于 DNA 類基因修飾系統(tǒng)，開發(fā)過程中需關(guān)注基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、脫靶效率、插入突變情況、目的基因在目的細(xì)胞中的整合位點及拷貝數(shù)等。采用的設(shè)計策略包括基因密碼子優(yōu)化、染色體同源序列的改構(gòu)、富含 GC 區(qū)序列的改構(gòu)、信號肽以及合理啟動子的應(yīng)用等。目前體外基因修飾常用的環(huán)狀 DNA 類基因修飾系統(tǒng)，包括質(zhì)粒、微環(huán)（Minicircle）DNA、納米質(zhì)粒（Nanoplasmid）等不同類型。不同類型環(huán)狀 DNA 的選擇可重點關(guān)注高純度載體制備的難易程度、載體重組、細(xì)菌來源 DNA 序列在目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)的表觀遺傳修飾對目的基因表達(dá)的影響等。此外，環(huán)狀 DNA 類基因修飾系統(tǒng)內(nèi)可引入特殊的 DNA 片段，形成游離型載體，如引入 EBV 來源的順式作用 DNA 片段 OriP 和反式作用的 EBNA1 基因的載體，此類載體需關(guān)注種屬、細(xì)胞類型對游離型載體功能的影響，載體重組、順式/反式作用 DNA 片段對目的基因表達(dá)的影響等。

對于 RNA 類基因修飾系統(tǒng)，以 mRNA 為例，根據(jù)目前的研究進(jìn)展，考慮到設(shè)計對 RNA 的穩(wěn)定性和其在目的細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)活性等可能具有顯著影響，構(gòu)建時可以關(guān)注堿基修飾類型和比例、5’-帽或帽類似物結(jié)構(gòu)、非翻譯區(qū)序列、 Poly（A）加尾結(jié)構(gòu)和自擴(kuò)增元件（如有）等，并同時進(jìn)行密碼子優(yōu)化、調(diào)控堿基間作用力及高級結(jié)構(gòu)等方面的改造，以實現(xiàn)預(yù)期的功能。

對于基因編輯系統(tǒng)，建議對靶向序列、目的基因序列（如有）和基因編輯用酶等的序列和比例等進(jìn)行優(yōu)化。通過特定細(xì)胞中的基因編輯效果確認(rèn)基因編輯用酶和靶向序列的特異性，篩選最佳的靶向結(jié)合序列（如 sgRNA 序列），并采取措施降低基因脫靶、插入突變的概率及對目的細(xì)胞基因組穩(wěn)定性的不良影響。對于轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，建議考慮整合位點的特異性和分布趨勢，以及轉(zhuǎn)座子在基因組中的移動（genomicmobilization）等特征，進(jìn)行轉(zhuǎn)座子序列、轉(zhuǎn)座酶及相應(yīng)調(diào)控元件的優(yōu)化，合理設(shè)置轉(zhuǎn)座序列/轉(zhuǎn)座酶的比例、序列分布等。

2. 生產(chǎn)用物料

基本原則可參考病毒載體類基因修飾系統(tǒng)部分的相關(guān)要求。

對于采用重組技術(shù)或生物/化學(xué)合成技術(shù)制備的生產(chǎn)用原材料，需明確工藝和質(zhì)量控制情況，特別是需要分析生產(chǎn)過程中可能引入的安全性相關(guān)雜質(zhì)。對于制備過程中使用的酶類試劑，建議重點關(guān)注酶的功能活性，例如需關(guān)注所用 DNA 聚合酶、RNA 聚合酶的保真度和活性，消化酶的酶解作用、酶的非特異性消化條件等，同時需要關(guān)注酶的純度、生產(chǎn)過程中引入的雜質(zhì)等。對于核苷酸、5’-帽或帽類似物等原材料，其整體的質(zhì)量應(yīng)符合制備的要求，建議關(guān)注鑒別、濃度、純度和雜質(zhì)等。制備過程建議避免使用氯化銫、溴化乙錠、氯仿等毒性物質(zhì)，避免使用動物源胰蛋白胨、核酸酶等可能引入外源因子等風(fēng)險的原材料。

對于用作遞送系統(tǒng)的材料，其制備涉及的關(guān)鍵原材料（脂質(zhì)、陽離子聚合物等）需進(jìn)行充分的篩選和質(zhì)量控制。

3. 制備工藝

基本要求同病毒載體類基因修飾系統(tǒng)。對于體外基因修飾后直接制備細(xì)胞產(chǎn)品的情況，需要多次、規(guī)模化的制備，具體情況介紹如下。

3.1 DNA 類基因修飾系統(tǒng)

以質(zhì)粒 DNA 為例，其制備步驟一般包括微生物培養(yǎng)及發(fā)酵、菌體收集、菌體裂解、質(zhì)粒純化、濃縮、灌裝等。工藝研究與確定過程需對關(guān)鍵工藝參數(shù)進(jìn)行探索和優(yōu)化，建立穩(wěn)定的制備工藝。關(guān)鍵工藝參數(shù)可能包括發(fā)酵培養(yǎng)基組成、發(fā)酵培養(yǎng)溫度、補料培養(yǎng)基組成、補料時間和補料量、溶氧量、堿裂解緩沖液及中和緩沖液的組成、堿裂解時間、層析柱載量、層析流速等。研究中建議關(guān)注制備全過程對質(zhì)粒結(jié)構(gòu)和功能可能的影響，如堿裂解步驟可能產(chǎn)生的質(zhì)粒不可逆變性的情況等。純化工藝開發(fā)過程中，可以根據(jù)質(zhì)粒的實際大小和性質(zhì)選擇合適的柱層析填料，最大程度去除宿主 RNA、宿主 DNA、DNA 碎片和細(xì)菌內(nèi)毒素等雜質(zhì)。根據(jù)研究，設(shè)置合理的過程控制指標(biāo)和可接受標(biāo)準(zhǔn)，如質(zhì)粒中間產(chǎn)物的濃度、超螺旋比例、雜質(zhì)殘留量等。

3.2 RNA 類基因修飾系統(tǒng)

基于研究現(xiàn)狀，RNA 的制備一般包括體外化學(xué)合成和 DNA 轉(zhuǎn)錄兩種工藝路線。體外化學(xué)合成工藝請參考化學(xué)藥物的相關(guān)技術(shù)指南。DNA 轉(zhuǎn)錄工藝路線以 mRNA 的制備工藝為例，該工藝一般采用 DNA 轉(zhuǎn)錄模板進(jìn)行 mRNA 體外轉(zhuǎn)錄、mRNA 加帽、去磷酸化、DNA 酶處理、mRNA 純化等步驟。建議對工藝參數(shù)進(jìn)行研究與優(yōu)化，開發(fā)穩(wěn)健的工藝，確保 mRNA 序列正確性、結(jié)構(gòu)完整性、生物學(xué)活性和不同批次間質(zhì)量的一致性。對工藝中引入的潛在雜質(zhì)進(jìn)行研究，明確雜質(zhì)的來源、去除步驟和去除能力等。工藝研究中需對關(guān)鍵工藝參數(shù)及控制范圍進(jìn)行確認(rèn)，如 NTP 濃度、轉(zhuǎn)錄時間、反應(yīng)溫度、加帽反應(yīng)物料投料比、層析介質(zhì)、動態(tài)載量等，關(guān)注產(chǎn)品回收率、雜質(zhì)去除率、加帽率、poly（A）長度及分布（如適用）、mRNA 片段的完整性以及序列的準(zhǔn)確性等方面。制備過程中需設(shè)置合理的過程控制指標(biāo)，如 mRNA 濃度、雙鏈 mRNA 含量、不完整 mRNA 含量、殘留 DNA、無菌、細(xì)菌內(nèi)毒素等。

3.3 其他

基因修飾系統(tǒng)如含有重組蛋白質(zhì)成分，根據(jù)具體情況，可以參考重組蛋白質(zhì)類生物制品生產(chǎn)的相關(guān)技術(shù)要求。

4. 質(zhì)量研究與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

4.1 質(zhì)量研究

質(zhì)量研究通常包括鑒別、結(jié)構(gòu)特征、理化特性、生物學(xué)活性、純度和雜質(zhì)分析等。研究中建議采用多個代表性批次開展研究。如含有化學(xué)合成的組分和/或重組蛋白組分的，可參考相關(guān)指導(dǎo)原則等開展質(zhì)量研究。

鑒別和序列確認(rèn)：鑒別研究中，可采用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，對酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，觀察是否存在特征性的帶型；也可以用 PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增，分析片段大小是否與理論大小一致等方法。對于 RNA，可將其逆轉(zhuǎn)錄為 DNA 后，采用上述方法進(jìn)行鑒別，或考慮采用其他適用的方法。序列確認(rèn)研究中，建議開展全序列測定，重點關(guān)注目的基因和調(diào)控元件的序列正確性，對于 RNA, 如有，建議同時關(guān)注 poly（A）序列的正確性。

結(jié)構(gòu)：建議采用適用的方法對結(jié)構(gòu)完整性和大小均一性進(jìn)行研究。如對于 DNA，可關(guān)注其是否存在單鏈、雙鏈、線性/開環(huán)、環(huán)狀和超螺旋等多種結(jié)構(gòu)形式，以及可能的高級結(jié)構(gòu)等；對于 mRNA，可關(guān)注其不同區(qū)域結(jié)構(gòu)的完整性（如 5’-帽或帽類似物結(jié)構(gòu)、poly（A）長度）、堿基修飾結(jié)構(gòu)、去磷酸化程度以及可能的高級結(jié)構(gòu)（如莖環(huán)結(jié)構(gòu)）等。若功能活性與高級結(jié)構(gòu)相關(guān)，建議分析研究高級結(jié)構(gòu)特征。對于復(fù)合核酸類基因修飾系統(tǒng)，建議開展結(jié)構(gòu)分析，如關(guān)注復(fù)合結(jié)構(gòu)的粒徑大小、粒度分布、顆粒聚集等。

理化特性：建議開展分子量、核酸濃度/含量、修飾位點及比例（如有）、物理特性（如 pH、滲透壓）等方面的研究。

生物學(xué)活性：根據(jù)作用機制，生物學(xué)活性研究通常包括對基因修飾效率、目的基因表達(dá)的水平、表達(dá)產(chǎn)物的功能或體外模擬生理功能的測定等。建議首選定量檢測方法，如可通過目的基因或基因編輯產(chǎn)物的表達(dá)量和功能進(jìn)行分析，關(guān)注表達(dá)產(chǎn)物是否與預(yù)計一致或蛋白表達(dá)/基因是否被抑制、空間結(jié)構(gòu)是否符合設(shè)計（如多聚體）等。當(dāng)采用體外轉(zhuǎn)染檢測細(xì)胞的方法時，需關(guān)注選擇的檢測細(xì)胞是否具有代表性和合理性。

純度：可以采用瓊脂糖凝膠電泳、高效液相色譜、毛細(xì)管電泳等方法開展純度的研究。對于復(fù)合核酸類基因修飾系統(tǒng)，建議關(guān)注包封率、游離核酸含量等。

雜質(zhì)：一方面，雜質(zhì)可能來自原材料、制備過程、制備和貯存過程中直接接觸容器和材料的溶解物。如 DNA 模板、酶類試劑、磁珠等原材料和添加的成分；乙醇、異丙醇等有機溶劑；宿主蛋白殘留、宿主 DNA 殘留、宿主 RNA 殘留等。另一方面，與基因修飾系統(tǒng)相關(guān)的雜質(zhì)，可能包括缺失、重排、雜交或突變序列等相關(guān)雜質(zhì)，建議進(jìn)行定性和定量的相關(guān)研究。對于 DNA 類基因修飾系統(tǒng)，相關(guān)研究可以包括開環(huán)/線性 DNA 含量、過度甲基化修飾的分子等。對于 mRNA 類基因修飾系統(tǒng)，相關(guān)研究可以包括降解/斷裂產(chǎn)生的 RNA 片段、加帽不完全的 mRNA、修飾過度的 RNA、 RNA 錯配序列、RNA 氧化產(chǎn)物等。結(jié)合制備工藝的雜質(zhì)清除能力，采用適用的方法對雜質(zhì)的殘留水平進(jìn)行分析，評估相關(guān)安全性風(fēng)險。

微生物安全性：可結(jié)合工藝過程，檢測可能引入的污染物，包括細(xì)菌、真菌、支原體（如適用）、細(xì)菌內(nèi)毒素等。

其他特性研究：對于使用基因編輯工具酶的修飾系統(tǒng)，質(zhì)量研究中建議持續(xù)關(guān)注對應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)品中修飾系統(tǒng)的殘留情況，采用生物信息學(xué)工具分析靶細(xì)胞基因組結(jié)構(gòu)變化、單點和小規(guī)模基因突變以及外源 DNA 在基因組中的插入位置、拷貝數(shù)等，監(jiān)控基因編輯用酶的細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)時間，考察脫靶效應(yīng)及相應(yīng)的安全性影響等。

4.2 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)風(fēng)險分析，結(jié)合工藝研究與驗證、臨床試驗及商業(yè)化批次質(zhì)量分析、穩(wěn)定性研究數(shù)據(jù)等制定合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，明確各檢測項對應(yīng)的分析方法、標(biāo)準(zhǔn)限度范圍并建立標(biāo)準(zhǔn)品 /參考品等。對于一般工藝相關(guān)雜質(zhì)，如經(jīng)充分驗證證明工藝可對其有效、穩(wěn)定地清除，可結(jié)合工藝進(jìn)行控制，相關(guān)殘留檢測可考慮不列于檢定項目中。

質(zhì)量控制項目可以包括理化性質(zhì)、純度和雜質(zhì)、生物學(xué)活性、微生物安全性等。其中，DNA 類的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可以納入外觀、pH 值、含量、鑒別、序列分析、純度、超螺旋比例、生物學(xué)活性、無菌檢測、細(xì)菌內(nèi)毒素、雜質(zhì)殘留等檢測項目。mRNA 類的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可以納入外觀、pH 值、含量、鑒別、序列分析、mRNA 完整性、加帽率、poly（A）長度及分布、生物學(xué)活性、無菌檢測、細(xì)菌內(nèi)毒素、雙鏈 RNA 殘留、溶劑殘留等檢測項目。常見的復(fù)合核酸類基因修飾系統(tǒng)的質(zhì)量控制項目包括外觀、pH、顆粒大小及分散系數(shù)、滲透壓、鑒別、序列測定、含量/濃度檢測、生物學(xué)活性、純度、序列完整性、包封率、復(fù)合材料各組分含量（例如脂質(zhì)鑒別和含量）、游離核酸、可見異物、雜質(zhì)、微生物安全性等。

方法學(xué)研究與驗證方面，基本原則同病毒載體類基因修飾系統(tǒng)的要求。

六、穩(wěn)定性研究與直接接觸性容器/材料研究  

（一）穩(wěn)定性研究

基因修飾系統(tǒng)如涉及到貯存，則需開展相應(yīng)的穩(wěn)定性研究。采用擬貯存階段樣品的代表性批次開展研究，一般包括貯存、運輸（如適用）和使用穩(wěn)定性研究等。研究開展前，需統(tǒng)籌制定穩(wěn)定性研究方案，關(guān)注各穩(wěn)定性研究所用樣品、直接接觸性容器/材料、檢測時間點、檢測條件和分析檢項等。

研究中需對能夠反映質(zhì)量變化的敏感特征進(jìn)行研究，如含量、完整性、純度、微生物安全性和生物學(xué)活性等。研究中需涵蓋擬定的各項條件，如溫度、光照、反復(fù)凍融（冷凍貯存時）、振搖等方面。根據(jù)實際使用情況，開展使用中穩(wěn)定性研究，例如復(fù)溶或解凍，與復(fù)溶稀釋劑的相容性等研究。研究中需采用與實際使用相同材質(zhì)的直接接觸性容器/材料。

對于病毒載體類基因修飾系統(tǒng)，穩(wěn)定性研究中建議重點考察病毒載體的滴度、純度、雜質(zhì)、微生物安全性指標(biāo)、生物學(xué)活性等關(guān)鍵質(zhì)量屬性。對于非病毒載體類基因修飾系統(tǒng)，建議重點關(guān)注理化特性、結(jié)構(gòu)完整性、雜質(zhì)等關(guān)鍵質(zhì)量屬性。例如，DNA 超螺旋結(jié)構(gòu)的比例可能影響 DNA 的轉(zhuǎn)染率， mRNA 加帽率可能影響 mRNA 的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和翻譯效率，建議在穩(wěn)定性研究中重點考察。

（二）直接接觸性容器/材料研究

如涉及貯存，需對直接接觸的包裝容器開展相應(yīng)的包材相容性研究。根據(jù)相容性研究結(jié)果，結(jié)合穩(wěn)定性研究，選擇合理的包裝容器。

另外，對制備工藝中與樣品接觸的容器和一次性使用材料（如貯存袋、過濾膜、層析介質(zhì)、管路等），需開展風(fēng)險評估和/或相應(yīng)的相容性研究。

七、參考文獻(xiàn)

[1] U.S.FDA. Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) information for human gene therapy Investigational New Drug applications (INDs). 2020.   

[2] 國家食品藥品監(jiān)督管理總局. 細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則(試行). 2017.   

[3] EMA. Guideline on development and manufacture of lentiviral vectors. 2005.   

[4] 國家食品藥品監(jiān)督管理總局.生物制品穩(wěn)定性研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）. 2015.  

[5] EMA. Quality, preclinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products. 2018.

[6] ICH. Q5A Viral safety evaluation of biotechnology products derived from cell lines of human or animal origin. 1999.  

[7] ICH. Q5C Stability testing of biotechnological and biological products. 1995.

[8] ICH. Q5D Derivation and characterization of cell substrates used for production of biotechnological/biological products. 1997.

[9] U.S. FDA. Testing of retroviral vector-based human gene therapy products for replication competent retrovirus during product manufacture and patient follow-up. 2020.

[10] EMA. Guideline on quality, non-clinical and clinical aspects of medicinal products containing genetically modified cells. 2020.