基因修飾細(xì)胞治療產(chǎn)品非臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）
2021年11月

目  錄  

一、前言
二、適用范圍
三、總體考慮
四、受試物
五、動物種屬/模型選擇
六、非臨床有效性與概念驗證
七、非臨床藥代動力學(xué)
八、非臨床安全性
（一）一般考慮 
（二） 轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的風(fēng)險評估
（三） 插入突變風(fēng)險評估
九、對特定類型基因修飾細(xì)胞產(chǎn)品的特殊考慮
（一） CAR 或 TCR 修飾的免疫細(xì)胞
（二） 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的細(xì)胞產(chǎn)品
（三） 采用基因編輯技術(shù)制備的細(xì)胞產(chǎn)品

一、前言 

近年來，隨著基因修飾技術(shù)的迅速發(fā)展，基因修飾細(xì)胞治療產(chǎn)品已成為醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點。由于基因修飾細(xì)胞治療產(chǎn)品物質(zhì)組成和作用方式與一般的化學(xué)藥品和生物制品有明顯不同，傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)非臨床研究策略和方法通常并不適用于基因修飾細(xì)胞治療產(chǎn)品。為規(guī)范和指導(dǎo)基因修飾細(xì)胞治療產(chǎn)品非臨床研究和評價，在《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則》（試行）基礎(chǔ)上，根據(jù)目前對基因修飾細(xì)胞治療產(chǎn)品的科學(xué)認(rèn)識，制定了本指導(dǎo)原則，提出了對基因修飾細(xì)胞治療產(chǎn)品非臨床研究和評價的特殊考慮和要求。隨著技術(shù)的發(fā)展、認(rèn)知程度的深入和相關(guān)研究數(shù)據(jù)的積累，本指導(dǎo)原則將不斷完善和適時更新。 
       二、適用范圍 

本指導(dǎo)原則適用于基因修飾細(xì)胞治療產(chǎn)品?；蛐揎椉?xì)胞治療產(chǎn)品是指經(jīng)過基因修飾（如調(diào)節(jié)、替換、添加或刪除等）以改變其生物學(xué)特性、擬用于治療人類疾病的活細(xì)胞產(chǎn)品，如基因修飾的免疫細(xì)胞，基因修飾的干細(xì)胞及其來源的細(xì)胞產(chǎn)品等。 
       三、總體考慮 

非臨床研究是藥物開發(fā)的重要環(huán)節(jié)之一。對于基因修飾細(xì)胞治療產(chǎn)品，充分的非臨床研究是為了：（1）闡明基因修飾的目的、功能以及產(chǎn)品的作用機(jī)制，明確其在擬定患者人群中使用的生物學(xué)合理性；（2）為臨床試驗的給藥途徑、給藥程序、給藥劑量的選擇提供支持性依據(jù)；（3）根據(jù)潛在風(fēng)險因素，闡明毒性反應(yīng)特征，預(yù)測人體可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)，確定不良反應(yīng)的臨床監(jiān)測指標(biāo)，為制定臨床風(fēng)險控制措施提供參考依據(jù)。因此，應(yīng)充分開展非臨床研究，收集用于風(fēng)險獲益評估的信息，以確立擬開發(fā)產(chǎn)品在目標(biāo)患者人群中預(yù)期具有合理的、可接受的獲益風(fēng)險比，同時為臨床試驗的設(shè)計和風(fēng)險控制策略的制定提供支持性依據(jù)。 

細(xì)胞經(jīng)基因修飾后會改變其生物學(xué)特性，同時也會帶來新的安全性風(fēng)險，如基因編輯脫靶風(fēng)險、載體插入突變風(fēng)險、載體重組風(fēng)險、表達(dá)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的風(fēng)險等。在制定非臨床研究計劃時，除參考《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則》（試行）中的對細(xì)胞治療產(chǎn)品的一般要求外，還應(yīng)具體問題具體分析，基于產(chǎn)品特點和目前已有的科學(xué)認(rèn)知，結(jié)合擬定適應(yīng)癥、患者人群、給藥途徑和給藥方案等方面的考慮，科學(xué)合理的設(shè)計和實施非臨床研究，充分表征產(chǎn)品的藥理學(xué)、毒理學(xué)和藥代動力學(xué)特征。在進(jìn)行獲益風(fēng)險評估時，還應(yīng)重點關(guān)注由非臨床向臨床過渡時非臨床研究的局限性和風(fēng)險預(yù)測的不確定性。 
       四、受試物 

非臨床研究所用受試物應(yīng)可代表臨床擬用樣品的質(zhì)量和安全性，關(guān)鍵性非臨床研究應(yīng)盡可能采用臨床擬用基因修飾細(xì)胞治療產(chǎn)品作為受試物。體外、體內(nèi)非臨床研究所使用的樣品均應(yīng)符合相應(yīng)開發(fā)階段的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。若后續(xù)制備工藝發(fā)生變更，應(yīng)闡明非臨床使用樣品與臨床擬用樣品的異同及其對人體有效性和安全性的可能影響。 

在某些情況下，受種屬特異性的限制，可考慮采用替代產(chǎn)品（表達(dá)動物同源基因的人源細(xì)胞產(chǎn)品或動物源替代細(xì)胞產(chǎn)品）。替代產(chǎn)品應(yīng)與臨床擬用產(chǎn)品采用相似的生產(chǎn)工藝，并對可能影響有效性和安全性的關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)進(jìn)行對比研究，以評估替代產(chǎn)品與臨床擬用產(chǎn)品的質(zhì)量相似性及其對非臨床數(shù)據(jù)預(yù)測性的影響。 
       五、動物種屬/模型選擇

進(jìn)行非臨床體內(nèi)研究時，應(yīng)盡可能選擇相關(guān)的動物種屬 /模型?；蛐揎椉?xì)胞應(yīng)能以其預(yù)期的作用方式在所選擇的動物中表現(xiàn)出所期望的功能活性。因此，選擇相關(guān)動物時需要考慮產(chǎn)品的特性以及臨床擬用情況，包括但不限于以下因素：
（1）動物對基因修飾細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)反應(yīng)與預(yù)期的人體反應(yīng)的相似性；（2）動物對異種來源的基因修飾細(xì)胞的免疫耐受性；（3）動物病理生理學(xué)特征與擬用患者人群的相似性；（4）臨床擬用遞送/給藥方式的可行性。 

由于免疫排斥反應(yīng)以及細(xì)胞和/或轉(zhuǎn)基因的種屬特異性，常規(guī)實驗動物很可能并不適用，而免疫缺陷動物、轉(zhuǎn)基因動物或采用同源替代產(chǎn)品作為受試物可能會更合適。對于某些作用機(jī)制涉及與疾病環(huán)境相互作用的基因修飾細(xì)胞（例如Chimeric Antigen Receptor T-Cell，CAR-T 細(xì)胞），采用疾病模型動物可能會提供有用的信息。 

每種動物種屬/模型均有其優(yōu)點和不足，沒有一種模型可全面預(yù)測基因修飾細(xì)胞在患者人群中的有效性和安全性。在選擇動物種屬時，應(yīng)評估所采用的動物種屬/模型與人體的相關(guān)性和局限性。若有多種相關(guān)動物模型，且這些模型可提供互補(bǔ)的證據(jù)，建議采用多種動物/模型開展研究。當(dāng)缺少相關(guān)動物模型時，可采用基于細(xì)胞和組織的模型（如二維或三維組織模型、類器官和微流體模型等）為有效性和安全性的評估提供有用的補(bǔ)充信息。 
       六、非臨床有效性與概念驗證 

對于基因修飾細(xì)胞治療產(chǎn)品，應(yīng)參照《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則》（試行）的要求進(jìn)行藥效學(xué)研究。 

此外，還應(yīng)進(jìn)行概念驗證試驗，闡明對細(xì)胞進(jìn)行基因修飾的理由和可行性。通常，對細(xì)胞進(jìn)行基因修飾的理由可能包括但不限于：（1）引入突變基因的功能拷貝以糾正遺傳性疾??；（2）改變/增強(qiáng)細(xì)胞的生物學(xué)功能；（3）引入一個安全開關(guān)，以在必要時能夠清除細(xì)胞。應(yīng)根據(jù)基因修飾的目的，進(jìn)行相應(yīng)的體外和體內(nèi)驗證試驗。 

概念驗證試驗評估終點可能包括：（1）對細(xì)胞基因組修飾的特異性；（2）引入的外源調(diào)控序列對內(nèi)源基因表達(dá)的影響，或轉(zhuǎn)基因的表達(dá)及功能活性；（3）基因修飾對細(xì)胞生物學(xué)特性和生理功能的影響。設(shè)計概念驗證試驗時，應(yīng)考慮設(shè)置合適的平行對照，如未修飾的細(xì)胞。 

雖然體外試驗可在一定程度上驗證基因修飾細(xì)胞的設(shè)計理念和擬定作用方式，但對于功能復(fù)雜的活細(xì)胞，僅依靠體外試驗并不足以預(yù)測基因修飾細(xì)胞的體內(nèi)行為和功能。因此，除非有充分的理由，均應(yīng)盡可能考慮進(jìn)行體內(nèi)概念驗證試驗。在設(shè)計體內(nèi)概念驗證試驗時，建議采用疾病模型動物。對于預(yù)期在人體內(nèi)會長期存續(xù)或長期發(fā)揮功能的基因修飾細(xì)胞，如果缺乏相關(guān)的動物模型，建議采用替代方法評估基因修飾細(xì)胞的潛在長期效應(yīng)，如采用替代產(chǎn)品進(jìn)行體內(nèi)概念驗證試驗，在足夠的、可行的時間窗內(nèi)評估基因修飾細(xì)胞的長期效應(yīng)。 
       七、非臨床藥代動力學(xué) 

參考《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則》（試行）中的對細(xì)胞治療產(chǎn)品藥代動力學(xué)的一般要求，采用相關(guān)動物模型開展藥代動力學(xué)試驗以闡明基因修飾細(xì)胞在體內(nèi)的命運(yùn)和行為（包括生物分布、遷移、歸巢、定植、增殖、分化和存續(xù)性）。這些試驗可以單獨開展，也可以整合到概念驗證試驗和/或毒理學(xué)試驗中。 

若基因修飾細(xì)胞表達(dá)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物可分泌到細(xì)胞外，應(yīng)闡明其在局部和/或全身的暴露特征及免疫原性。 

八、非臨床安全性 
     （一）一般考慮

由于不同基因修飾細(xì)胞治療產(chǎn)品的細(xì)胞的來源、類型、生物學(xué)特性、基因修飾方式/技術(shù)、生物學(xué)功能/作用方式、生產(chǎn)工藝、非細(xì)胞組分等各不相同，在制定非臨床安全性評價策略時，除參考《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則》（試行）中對細(xì)胞治療產(chǎn)品的一般要求外，還應(yīng)基于每個產(chǎn)品的特點，具體問題具體分析。在制定非臨床安全性評價策略時，考慮因素包括但不限于：（1）臨床擬用適應(yīng)癥、目標(biāo)患者人群和臨床給藥方案；（2）細(xì)胞的來源、類型及其在體內(nèi)的細(xì)胞命運(yùn)；（3）基因修飾目的、方式及技術(shù)；（4）作用方式/機(jī)制或預(yù)期的功能活性；（5）誘導(dǎo)免疫應(yīng)答/免疫耐受；（6）產(chǎn)品的質(zhì)量因素；（7）已有的非臨床/臨床數(shù)據(jù)；（8）類似產(chǎn)品的已知有效性和安全性信息。 

基因修飾細(xì)胞治療產(chǎn)品的非臨床安全性研究一般應(yīng)當(dāng)在經(jīng)過藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范（GLP）認(rèn)證的機(jī)構(gòu)開展，并遵守藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范。對于某些采用特殊動物模型、藥理毒理整合性研究、特殊指標(biāo)檢測等非常規(guī)試驗內(nèi)容，可以考慮在非 GLP 條件下進(jìn)行，但應(yīng)保證數(shù)據(jù)的質(zhì)量和完整性。 
     （二）轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的風(fēng)險評估

通常，轉(zhuǎn)基因會隨基因修飾細(xì)胞的存在而持續(xù)表達(dá)，對于有復(fù)制能力的細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因還可能會隨細(xì)胞的增殖而過度表達(dá)，導(dǎo)致基因表達(dá)產(chǎn)物的蓄積，進(jìn)而導(dǎo)致毒性。因此，若基因修飾細(xì)胞編碼表達(dá)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，應(yīng)在體內(nèi)試驗中評估轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的毒性風(fēng)險。在設(shè)計試驗時，應(yīng)根據(jù)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)情況和功能活性設(shè)計試驗期限和必要的終點指標(biāo)，考慮因素包括：（1）基因表達(dá)水平和持續(xù)時間；（2）基因表達(dá)產(chǎn)物的分布部位；（3）基因表達(dá)產(chǎn)物的功能活性。 

一些轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物（如，生長因子、生長因子受體、免疫調(diào)節(jié)物等）若長期持續(xù)表達(dá)，可能會存在長期安全性風(fēng)險，如導(dǎo)致細(xì)胞非受控的生長、惡性轉(zhuǎn)化等不良反應(yīng)。因此，對于長期持續(xù)表達(dá)或具有長期效應(yīng)的轉(zhuǎn)基因修飾細(xì)胞，非臨床安全性研究的期限應(yīng)足以評估其長期安全性風(fēng)險。為確定基因表達(dá)產(chǎn)物的量效關(guān)系，解釋預(yù)期和非預(yù)期的試驗結(jié)果，建議在試驗中伴隨對轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的定量檢測以及免疫原性檢測。 
     （三）插入突變風(fēng)險評估 

一些整合性載體（如逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、轉(zhuǎn)座子）可將外源基因插入整合到細(xì)胞基因組中，這可能會導(dǎo)致關(guān)鍵基因突變或激活原癌基因，從而導(dǎo)致惡性腫瘤風(fēng)險增加。 

影響插入突變的關(guān)鍵風(fēng)險因素包括：（1）載體的整合特征，如插入位點的偏好性；（2）載體的設(shè)計，如增強(qiáng)子、啟動子等構(gòu)建元件的活性，影響鄰近基因的潛力；產(chǎn)生剪接突變體的潛在剪接位點或多聚腺苷酸信號等；（3）細(xì)胞載體拷貝數(shù)；4）轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的功能活性（如與細(xì)胞生長調(diào)控相關(guān)）和表達(dá)水平；5）靶細(xì)胞群的轉(zhuǎn)化可能性，這可能與細(xì)胞的分化狀態(tài)、增殖潛力、體外培養(yǎng)條件和體內(nèi)植入環(huán)境等有關(guān)。 

基于已有科學(xué)經(jīng)驗和既往非臨床/臨床研究結(jié)果，如果認(rèn)為基因修飾細(xì)胞所采用的載體系統(tǒng)可將外源基因整合到細(xì)胞基因組中并可在體內(nèi)長期存續(xù)，需綜合分析以上風(fēng)險因素，評估潛在的插入突變、致瘤/致癌性風(fēng)險。非臨床研究，應(yīng)采用具有代表性的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行基因整合位點分析，分析細(xì)胞的克隆組成以及在關(guān)注基因（如腫瘤相關(guān)調(diào)控基因）附近有無優(yōu)先整合跡象，含有關(guān)注整合位點的細(xì)胞有無優(yōu)先異常增殖。 
       九、對特定類型基因修飾細(xì)胞產(chǎn)品的特殊考慮 
       鑒于基因修飾細(xì)胞的產(chǎn)品種類繁多、各有特點，除上述一般技術(shù)要求外，還應(yīng)基于產(chǎn)品的特性進(jìn)行相應(yīng)的特殊考慮。本指導(dǎo)原則列舉了以下三種情形的特殊考慮。  
     （一）CAR或TCR修飾的免疫細(xì)胞 

對于嵌合抗原受體（Chimeric antigen receptor，CAR）或 T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）修飾的免疫細(xì)胞，應(yīng)盡可能采用多種方法評估其靶點相關(guān)毒性和脫靶毒性風(fēng)險。 

對于靶點相關(guān)毒性，應(yīng)采用體外方法深入分析靶點在人體器官、組織和細(xì)胞中的表達(dá)分布情況，基因表達(dá)分析庫和文獻(xiàn)調(diào)研也可能會有助于闡明靶點在不同病理生理狀態(tài)下的表達(dá)是否存在差異。應(yīng)采用表達(dá)和不表達(dá)靶抗原的細(xì)胞作為靶細(xì)胞進(jìn)行體外試驗，確認(rèn)CAR或TCR修飾的免疫細(xì)胞可特異性的識別和殺傷靶細(xì)胞。 

對于CAR修飾的免疫細(xì)胞，應(yīng)采用多種體外方法評估其胞外抗原識別區(qū)的脫靶風(fēng)險。 

TCR修飾免疫細(xì)胞的脫靶毒性可通過評估TCR與人體自身抗原肽的交叉識別能力來評估。首先，應(yīng)采用體外試驗測定TCR修飾的免疫細(xì)胞與人自身抗原肽-HLA（與遞呈靶抗原肽的HLA等位基因相同）復(fù)合物的親和力，并說明抗原肽的選擇依據(jù)及選擇范圍。此外，還應(yīng)研究其他相關(guān)或不相關(guān)的蛋白中是否含有靶抗原肽序列。如果TCR與人自身抗原肽有交叉反應(yīng)可能，應(yīng)確定靶抗原肽的最小識別基序（motif），并采用計算機(jī)預(yù)測分析評估交叉反應(yīng)性。如果計算機(jī)預(yù)測可識別出具有潛在交叉反應(yīng)性的抗原肽，應(yīng)在體外測定TCR修飾免疫細(xì)胞對表達(dá)相應(yīng)蛋白或遞呈相應(yīng)抗原肽的的細(xì)胞的識別能力。如果不能排除交叉反應(yīng)性，應(yīng)基于含有潛在交叉反應(yīng)性抗原肽的蛋白的表達(dá)模式以及TCR與潛在交叉反應(yīng)性抗原肽的親和力來進(jìn)行風(fēng)險評估。為獲得TCR與其他等位HLA 潛在交叉反應(yīng)性的信息，應(yīng)進(jìn)行充分的HLA交叉反應(yīng)性篩選。 

對于TCR修飾的T細(xì)胞，還應(yīng)關(guān)注引入TCR鏈和內(nèi)源性 TCR之間的錯配可能性，應(yīng)描述和說明旨在降低錯配可能性的TCR設(shè)計策略。 
     （二）誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的細(xì)胞產(chǎn)品

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell，iPS）自身具有致瘤性風(fēng)險，在體內(nèi)可形成畸胎瘤，整合病毒載體的使用和誘導(dǎo)多能性可能增加iPS細(xì)胞插入致突變性和致癌性的風(fēng)險。因此，應(yīng)在首次臨床試驗前完成致瘤性試驗。若設(shè)計科學(xué)合理，能夠滿足評價要求，也可在持續(xù)時間足夠長的毒性研究中評估致瘤性風(fēng)險。體內(nèi)致瘤性試驗建議采用摻入未分化iPS細(xì)胞的細(xì)胞產(chǎn)品作為陽性對照，以確認(rèn)實驗系統(tǒng)的靈敏度。如果iPS細(xì)胞設(shè)計了自殺機(jī)制以降低致瘤風(fēng)險，應(yīng)在體內(nèi)試驗中確認(rèn)/驗證此類自殺機(jī)制的功能 

重編程可能會誘導(dǎo)細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)改變，其后果尚不完全清楚。為評估iPS細(xì)胞衍生細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)改變所引起的潛在異常特征，應(yīng)采用體外和/或體內(nèi)非臨床研究來闡明細(xì)胞具有適當(dāng)?shù)男袨楹蜕砉δ埽纠韺W(xué)試驗還應(yīng)評估細(xì)胞異常行為引起的不良反應(yīng)。應(yīng)結(jié)合質(zhì)量表征數(shù)據(jù)、非臨床安全性數(shù)據(jù)以及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行深入的風(fēng)險評估，并就旨在保護(hù)患者安全的風(fēng)險減輕措施進(jìn)行討論。如果發(fā)現(xiàn)遺傳學(xué)和/或表觀遺傳學(xué)改變，應(yīng)解決相應(yīng)的安全性問題。 
     （三）采用基因編輯技術(shù)制備的細(xì)胞產(chǎn)品 

對于采用基因編輯技術(shù)制備的基因修飾細(xì)胞產(chǎn)品，應(yīng)進(jìn)行體外在靶和脫靶活性評估，以確認(rèn)修飾酶或向?qū)NA對靶基因序列的特異性。在評估基因編輯的脫靶風(fēng)險時，應(yīng)說明所選擇的評價策略的合理性和敏感性。雖然采用計算機(jī)分析預(yù)測基因編輯的潛在脫靶位點，并對潛在脫靶位點進(jìn)行深度測序分析，可用于評估基因編輯的脫靶風(fēng)險；但選擇的評價策略仍應(yīng)包含體外全基因組測序比對，以證明潛在脫靶位點未出現(xiàn)脫靶。此外，在評估脫靶活性時，還應(yīng)評估種屬特異性的差異、細(xì)胞病理生理狀態(tài)的差異或細(xì)胞類型的差異對非臨床數(shù)據(jù)預(yù)測性的影響。必要時，還應(yīng)分析基因編輯對細(xì)胞表型和生理功能的潛在影響。 

參考文獻(xiàn) 

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5. Long Term Follow-Up After Administration of Human Gene Therapy Products. FDA, 2020.

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