人源干細(xì)胞產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）

國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心

2023年4月

目  錄 

一、前言
二、適用范圍
三、一般考慮
（一）生物學(xué)活性
（二） 定向分化和非預(yù)期生物學(xué)效應(yīng)
（三） 成瘤性和致瘤性
（四） 多能干細(xì)胞殘留
（五） 遺傳和表觀遺傳學(xué)研究
（六） 基因修飾細(xì)胞的研究
（七）其他應(yīng)關(guān)注的共性問題
四、生產(chǎn)用物料
（一）原材料
（二）輔料
（三）接觸性耗材、容器和藥械組合 
五、生產(chǎn)工藝
（一）工藝開發(fā)
（二）工藝變更
（三）工藝驗(yàn)證
六、質(zhì)量研究與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
（一）質(zhì)量研究
（二）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
七、穩(wěn)定性研究
八、包裝及密封容器系統(tǒng)
九、名詞解釋
十、參考文獻(xiàn)

一、前言

2017 年，原國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》，對按照藥品管理相關(guān)法律法規(guī)進(jìn)行研發(fā)的細(xì)胞治療產(chǎn)品的技術(shù)要求進(jìn)行了總體闡述。隨著干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展、認(rèn)知的深入和經(jīng)驗(yàn)的積累，相關(guān)產(chǎn)品的技術(shù)要求亦隨之逐步修訂和完善。為進(jìn)一步規(guī)范和指導(dǎo)干細(xì)胞產(chǎn)品的藥學(xué)研發(fā)和申報，促進(jìn)干細(xì)胞產(chǎn)業(yè)發(fā)展，制定本技術(shù)指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是基于現(xiàn)有認(rèn)識，對按照藥品進(jìn)行研發(fā)的干細(xì)胞產(chǎn)品藥學(xué)研究的技術(shù)問題提供建議。此外，申請人/持有人亦可根據(jù)干細(xì)胞產(chǎn)品研發(fā)的實(shí)際情況，在符合藥物研發(fā)的規(guī)律并提供科學(xué)合理的依據(jù)的前提下，采用其他有效的方法和手段。

二、適用范圍

本指導(dǎo)原則主要為按照藥品管理相關(guān)法規(guī)進(jìn)行研發(fā)和注冊申報的人源干細(xì)胞產(chǎn)品的上市申請階段的藥學(xué)研究提供技術(shù)指導(dǎo)。

本指導(dǎo)原則中的“人源干細(xì)胞產(chǎn)品”是指起源于人的成體（干）細(xì)胞（adult stem cells，ASCs or adult cells）、人胚干細(xì)胞（embryonic stem cells,ESCs）和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs），經(jīng)過一系列涉及干細(xì)胞的體外操作，一般包括擴(kuò)增、基因修飾、誘導(dǎo)分化、轉(zhuǎn)（分）化等，獲得的干細(xì)胞及其衍生細(xì)胞，加入制劑輔料，分裝至特定容器，并符合特定藥品放行標(biāo)準(zhǔn)，可直接應(yīng)用,也可與組織工程材料組合應(yīng)用于臨床的治療產(chǎn)品。其中，由于涉及人類細(xì)胞，生產(chǎn)用細(xì)胞需符合國家倫理方面的相關(guān)規(guī)定。

由于人源干細(xì)胞產(chǎn)品可能涉及多方面的技術(shù)要求，在參考本指導(dǎo)原則的同時，也可同時參考其他藥品、細(xì)胞治療、基因治療等方面的相關(guān)指導(dǎo)原則。本指導(dǎo)原則不涉及生殖細(xì)胞、造血干細(xì)胞移植等產(chǎn)品。

三、一般考慮

干細(xì)胞具備自我更新和多向分化潛能。干細(xì)胞產(chǎn)品的細(xì)胞類型多樣，產(chǎn)品細(xì)胞本身具備體內(nèi)生存、增殖和/或分化、細(xì)胞間相互作用等能力。干細(xì)胞產(chǎn)品的生產(chǎn)流程一般包括供者材料的獲取、運(yùn)輸、接收，細(xì)胞系/庫建立與檢定，生產(chǎn)、檢驗(yàn)、放行、儲存和運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)。在干細(xì)胞產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝設(shè)計(jì)與驗(yàn)證、質(zhì)量研究和控制、穩(wěn)定性研究等研發(fā)過程中，應(yīng)對以上各個環(huán)節(jié)的干細(xì)胞特性進(jìn)行充分考慮。

干細(xì)胞產(chǎn)品應(yīng)遵循藥物研發(fā)的一般規(guī)律。臨床試驗(yàn)申請階段需滿足安全性的要求，樣品的制備應(yīng)符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范-臨床試驗(yàn)用藥品附錄》的要求；臨床試驗(yàn)期間繼續(xù)完善生產(chǎn)工藝和產(chǎn)品質(zhì)量等相關(guān)研究；申請上市時提供支持產(chǎn)品安全、有效、質(zhì)量可控的完整的研究數(shù)據(jù)。

（一）生物學(xué)活性

干細(xì)胞產(chǎn)品的生物學(xué)活性是產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，涉及產(chǎn)品質(zhì)量、效能、批次間質(zhì)量一致性、可比性研究和穩(wěn)定性等方面的評價，對其研究需貫穿于臨床前、早期臨床、關(guān)鍵性臨床和上市及上市后研究的整個生命周期。對于不同來源的各類產(chǎn)品的生物學(xué)活性研究，應(yīng)根據(jù)各類干細(xì)胞產(chǎn)品的特點(diǎn),具體情況具體分析。比如，應(yīng)考慮：特異性標(biāo)志物在不斷發(fā)現(xiàn)和更新；工藝中適用于大規(guī)模生產(chǎn)的篩選和鑒定方法在不斷探索，變得日益高效和規(guī)范；產(chǎn)品批間的分化效率、均一性有待提高；功能性細(xì)胞的驗(yàn)證策略不盡相同，以致相應(yīng)的產(chǎn)品放行驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)缺乏可靠依據(jù)等。在設(shè)定產(chǎn)品生物學(xué)活性標(biāo)準(zhǔn)的過程中，應(yīng)對產(chǎn)品屬性進(jìn)行廣泛研究，收集足夠的產(chǎn)品表征數(shù)據(jù)（即分子、生化、免疫學(xué)、表型、物理和生物學(xué)特性等），同時追蹤科研進(jìn)展和臨床發(fā)現(xiàn)，積極努力探索哪些產(chǎn)品屬性與效能最相關(guān)，確保符合確定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)或驗(yàn)收限度產(chǎn)品批次均可為患者接受，保證產(chǎn)品的安全有效性。

（二）定向分化和非預(yù)期生物學(xué)效應(yīng)

在體外采用定向分化策略進(jìn)行干細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)時，誘導(dǎo)或抑制材料及其劑量、添加順序、維持時間及終點(diǎn)殘留量等都會顯著影響分化效率，并帶來質(zhì)量和安全性風(fēng)險，尤其是誘導(dǎo)分化過程中非目的細(xì)胞等雜質(zhì)引起的風(fēng)險，細(xì)胞在加工后發(fā)生非預(yù)期變化的風(fēng)險，以及同時受遷移至體內(nèi)局部微環(huán)境影響導(dǎo)致的非預(yù)期生物學(xué)效應(yīng)的風(fēng)險等。因此，在干細(xì)胞產(chǎn)品的研發(fā)和生產(chǎn)過程中，應(yīng)重視關(guān)注產(chǎn)品的分化階段的監(jiān)測，如胚層的基因標(biāo)志物，基因編輯造血干細(xì)胞中的干性維持的標(biāo)志物等，確定合理的標(biāo)志物檢測體系，保證終產(chǎn)品的定向分化，預(yù)防控制由于非定向分化而產(chǎn)生的非預(yù)期生物學(xué)效應(yīng)。

（三）成瘤性和致瘤性

干細(xì)胞產(chǎn)品可能具有較高的成瘤性和致瘤性風(fēng)險，相關(guān)的風(fēng)險因素比如：（1）干細(xì)胞復(fù)雜的制備工藝、長時間的細(xì)胞傳代和離體操作；（2）干細(xì)胞產(chǎn)品中可能殘留未分化細(xì)胞、非預(yù)期分化細(xì)胞、惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞、突變；（3）細(xì)胞培養(yǎng)過程中的遺傳和表觀遺傳變異/不穩(wěn)定性；（4）基因修飾可能引入的高風(fēng)險基因元件以及基因/病毒載體插入所導(dǎo)致的致癌基因活化或抑癌基因失活等。為了控制上述風(fēng)險，應(yīng)進(jìn)行評估和控制干細(xì)胞產(chǎn)品的成瘤性、致瘤性。

（四）多能干細(xì)胞殘留

ESCs/iPSCs 衍生細(xì)胞治療產(chǎn)品可能因少量殘留的多能干細(xì)胞以及持續(xù)增殖的分化子代細(xì)胞，導(dǎo)致出現(xiàn)畸胎瘤、其他錯誤模式腫瘤或癌前病變等風(fēng)險。這些風(fēng)險建議通過 ESCs/iPSCs 細(xì)胞系選擇、高效定向分化、嚴(yán)格純化等方式，并著力開發(fā)檢測最終產(chǎn)品中未分化多能干細(xì)胞污染的敏感檢測方法（特別是在提供局部高密度大劑量細(xì)胞時），進(jìn)行有效控制。鼓勵通過核型分析、全基因組和表觀遺傳組水平的綜合分析及風(fēng)險分析，評估腫瘤發(fā)生的潛在可能。

（五）遺傳和表觀遺傳學(xué)研究

對于經(jīng)過體外復(fù)雜操作的干細(xì)胞產(chǎn)品，以及多能干細(xì)胞衍生產(chǎn)品，建議結(jié)合細(xì)胞特性，在合適階段對過程樣品或終產(chǎn)品進(jìn)行遺傳和表觀遺傳的穩(wěn)定性評估（如基因突變分析、去乙?；瘷z測等）。適用于干細(xì)胞產(chǎn)品的遺傳和表觀遺傳學(xué)評估的分析方法和評價標(biāo)準(zhǔn)正在發(fā)展，可對任何這類檢測的局限性進(jìn)行評估，并與任何特定病例的風(fēng)險/利益和患者人數(shù)進(jìn)行權(quán)衡。某些情況下，干細(xì)胞產(chǎn)品的基因組突變以及遺傳病有關(guān)的基因突變等風(fēng)險可通過測序方法輔助分析和控制。  

（六）基因修飾細(xì)胞的研究

基因修飾工藝開發(fā)應(yīng)明確基因修飾方法、元件設(shè)計(jì)和操作條件，充分研究后明確基因物質(zhì)的轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)染方式和效率。對目的基因在基因組的整合情況/整合特征（插入位點(diǎn)、插入拷貝數(shù)、優(yōu)勢克隆異常生長等）、目的基因表達(dá)產(chǎn)物的功能進(jìn)行評估。應(yīng)充分研究基因編輯的靶向性、基因物質(zhì)在目標(biāo)細(xì)胞群中的表達(dá)效率。應(yīng)對修飾細(xì)胞的染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、基因組穩(wěn)定性、目的基因的遺傳和表達(dá)穩(wěn)定性、脫靶編輯、轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)染用載體的殘留量以及病毒復(fù)制能力回復(fù)突變等進(jìn)行深入分析研究。還需考慮基因修飾的其他影響，如對細(xì)胞活性、干性、表型、功能、特性、工藝相關(guān)雜質(zhì)和非目的細(xì)胞群變化等。

（七）其他應(yīng)關(guān)注的共性問題

干細(xì)胞產(chǎn)品具備其他細(xì)胞治療產(chǎn)品相關(guān)的共性質(zhì)量風(fēng)險因素，比如：（1）不同供者、同一供者不同組織來源的細(xì)胞具有較大的差異性，以及供者年齡、健康情況、組織來源與目標(biāo)治療組織的細(xì)胞譜系差異等，均有可能對產(chǎn)品質(zhì)量有較大影響。（2）細(xì)胞培養(yǎng)過程中可能不得不添加人源/動物源材料，操作過程中可能引入的外源因子，均存在污染和交叉污染的風(fēng)險。對于異體產(chǎn)品，更需關(guān)注外源因子引入或傳播的風(fēng)險。（3）自體產(chǎn)品批量有限，檢測材料不足。（4）對于非凍存的新鮮制劑，產(chǎn)品有效期短。（5）產(chǎn)品批次數(shù)據(jù)積累有限，關(guān)鍵工藝參數(shù)（CPP）和關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）認(rèn)知有限。（6）產(chǎn)品可能發(fā)生多輪工藝變更，產(chǎn)品質(zhì)量無法完全精確表征等。針對上述的風(fēng)險因素，控制策略應(yīng)該考慮以下方面：

（1） 生產(chǎn)環(huán)境方面，建立清場和隔離操作規(guī)范，并盡量采用連續(xù)、密閉式設(shè)備、設(shè)施，減少生產(chǎn)過程中的環(huán)境暴露環(huán)節(jié)。

（2） 原材料方面，持續(xù)進(jìn)行供者材料和細(xì)胞庫的資格鑒定及適用性評估，進(jìn)行科學(xué)合理的供者篩選，并關(guān)注替代細(xì)胞庫的再生產(chǎn)，做好細(xì)胞庫和工藝中間品的穩(wěn)定性研究。對其他原材料供應(yīng)商進(jìn)行評估、審核，對不得不用的人源/動物源原材料嚴(yán)格質(zhì)控。

（3） 生產(chǎn)工藝和過程控制方面，建立完善的可追溯系統(tǒng)，同時關(guān)注生產(chǎn)過程中的細(xì)胞鑒別檢測，做好上下游材料批號和標(biāo)識管理，防止混淆和差錯。加強(qiáng)對細(xì)胞庫和未處理收獲液的分析檢測，在生產(chǎn)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，對樣品的有關(guān)檢項(xiàng)，如無菌、內(nèi)毒素、支原體、內(nèi)外源病毒等均應(yīng)符合要求。明確合理的過程控制指標(biāo)和廢棄指標(biāo)，對工藝中間品進(jìn)行檢定或質(zhì)量監(jiān)測。

（4） 質(zhì)量研究和質(zhì)量控制方面，質(zhì)量源于設(shè)計(jì)的理念（quality by design）同樣適用于干細(xì)胞產(chǎn)品，應(yīng)盡早開展產(chǎn)品和工藝的表征，以及分析檢測方法的開發(fā)，對產(chǎn)品進(jìn)行全面的質(zhì)量特性分析和數(shù)據(jù)收集，加強(qiáng)對產(chǎn)品關(guān)鍵質(zhì)量屬性的合理判斷，并結(jié)合適用可靠的分析方法制定全面有效的質(zhì)量控制策略，確保產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定一致。由于這類產(chǎn)品往往難以精確表征，可通過加強(qiáng)原材料控制、過程控制和工藝中間品的檢測來補(bǔ)充放行檢測。在一些情況下，可以采用經(jīng)過驗(yàn)證的快速、微量的新型放行檢測方法輔助傳統(tǒng)檢測方法。進(jìn)行規(guī)范的生產(chǎn)工藝開發(fā)、轉(zhuǎn)移與驗(yàn)證。

在開發(fā)過程中甚至上市后，常常發(fā)生原材料和工藝的變更，在前期有關(guān)工藝與質(zhì)量的關(guān)系的知識積累基礎(chǔ)上，了解原材料和工藝的變更可能對產(chǎn)品質(zhì)量的影響，應(yīng)針對變更開展系統(tǒng)的可比性研究，結(jié)合產(chǎn)品和工藝特點(diǎn)持續(xù)進(jìn)行質(zhì)量特性研究，充分表征細(xì)胞形態(tài)、活性、遺傳穩(wěn)定性、成瘤性/致瘤性、細(xì)胞表型特征 (包括預(yù)期和非預(yù)期細(xì)胞群等)和生物學(xué)活性等，尤其關(guān)注影響產(chǎn)品質(zhì)量的干細(xì)胞特性檢測（如適用）。

（5） 穩(wěn)定性方面，采用代表性批次和樣品開展研究，穩(wěn)定性研究中設(shè)置敏感的指標(biāo)，如細(xì)胞活率和生物學(xué)活性。積累多批次數(shù)據(jù)，了解產(chǎn)品質(zhì)量的變化趨勢，為產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)和效期的制定，以及可比性評價等提供依據(jù)。

四、生產(chǎn)用物料

生產(chǎn)用物料包括生產(chǎn)過程中使用的所有原材料、輔料、耗材等，其來源和質(zhì)量應(yīng)當(dāng)清晰可靠。來自生產(chǎn)用物料的外源因子引入或傳播的風(fēng)險應(yīng)該進(jìn)行最大限度地控制。應(yīng)對物料供應(yīng)商及合同生產(chǎn)商進(jìn)行評估、審核，分清責(zé)任主體，確保物料質(zhì)量。

（一）原材料

原材料包括起始原材料（生產(chǎn)用細(xì)胞、生產(chǎn)輔助細(xì)胞、體外基因修飾系統(tǒng)等）和其他原材料（如培養(yǎng)基和細(xì)胞因子）。原材料的質(zhì)量直接關(guān)系到終產(chǎn)品的質(zhì)量，在基于科學(xué)和基于風(fēng)險的原則下進(jìn)行風(fēng)險評估和質(zhì)量控制，應(yīng)符合現(xiàn)行版《中國藥典》“生物制品生產(chǎn)用原材料及輔料質(zhì)量控制”和“生物制品生產(chǎn)檢定用動物細(xì)胞基質(zhì)制備及質(zhì)量控制”的要求。

1. 起始原材料

1.1 生產(chǎn)用細(xì)胞

生產(chǎn)用細(xì)胞可能直接來源于供者（自體或同種異體），也可能來源于細(xì)胞庫，其來源應(yīng)當(dāng)穩(wěn)定，且質(zhì)量一致。

生產(chǎn)用細(xì)胞的來源和相關(guān)操作應(yīng)符合國家相關(guān)法律法規(guī)和倫理的要求，應(yīng)取得相關(guān)方的知情同意，建立“知情與保密”管理體系。

1.1.1 供者篩查

供者篩查是干細(xì)胞產(chǎn)品質(zhì)量風(fēng)險控制的重要手段。建立合理的供者篩查程序和標(biāo)準(zhǔn)對防范病毒污染、組織排異、相關(guān)疾病等風(fēng)險十分必要。篩查時應(yīng)盡量收集供者的相關(guān)特征，包括但不限于一般信息（如年齡、性別、血型、健康情況、生活習(xí)慣）、既往病史和家族史（尤其關(guān)注傳染病和遺傳病）、用藥史和輻射暴露等。供者篩查還需區(qū)別自體供者和同種異體供者的風(fēng)險差異，進(jìn)行不同的考慮和要求。

供者的病原微生物感染篩查方面，尤其對于同種異體供者，可參考采供血的相關(guān)要求，如篩查供者是否存在 HBV、HCV、HIV、梅毒螺旋體等感染。實(shí)際研發(fā)應(yīng)用中，還應(yīng)根據(jù)供者細(xì)胞類型、供者健康/疾病史或區(qū)域流行病區(qū)旅居、細(xì)胞/組織特異性的易感病原體等具體情況適當(dāng)增加相應(yīng)的篩查項(xiàng)目，并列入驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。比如，對于富含白細(xì)胞的活細(xì)胞和組織的供者，建議篩查 HTLV1和 HTLV-2、CMV 等。對于自體供者，可根據(jù)來源的組織或器官、干細(xì)胞產(chǎn)品的特性以及臨床適應(yīng)癥等，適當(dāng)調(diào)整篩查項(xiàng)目和標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)確定生產(chǎn)過程等是否會增加供者成為傳染源的病原體傳播風(fēng)險，并說明采取的預(yù)防措施（為防止病毒或其他外源性因子傳播給自體受者以外的其他人）。為了保證病原體篩查結(jié)果的可靠性，供者篩查應(yīng)盡可能采用監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的血源篩查試劑盒檢測病原體；對于無血源篩查試劑情況下，可采用已批準(zhǔn)的體外診斷試劑，檢測方法應(yīng)經(jīng)過適用性確認(rèn)，關(guān)注檢測方法靈敏度對病原微生物的檢出能力；如無批準(zhǔn)的檢測方法或產(chǎn)品，可以采用經(jīng)過全面方法學(xué)驗(yàn)證的自建方法。制備通用型干細(xì)胞產(chǎn)品時，必須考慮窗口期對供者病原微生物感染的篩查的影響。組織排異方面的風(fēng)險，可參考輸血和器官移植供者的相關(guān)要求，比如收集供者的 ABO 血型、Rh 血型、HLA-I 類和 II 類分型信息等。建議根據(jù)產(chǎn)品類型和臨床應(yīng)用要求等考慮供者與受者的組織配型問題。存在組織排異風(fēng)險、免疫原性高的情況下，應(yīng)臨床檢測組織配型相容性。對于非國標(biāo)方法，需應(yīng)提供檢測方法和依據(jù)。

建議結(jié)合先進(jìn)的分析檢測技術(shù)充分評估受者被引入疾病的潛在風(fēng)險，如對異體供者進(jìn)行致病基因方面的檢測。

為了開發(fā)細(xì)胞庫來源的干細(xì)胞產(chǎn)品，應(yīng)延伸對該細(xì)胞庫的供者進(jìn)行篩查，比如臍帶干細(xì)胞供者的檢測對象建議擴(kuò)展到包括適當(dāng)時間間隔內(nèi)的母親外周血和組織采集當(dāng)天胎兒的臍帶血等。

1.1.2 供者組織和細(xì)胞

供者組織的獲取需遵循與人體組織獲取相關(guān)的規(guī)范指南，還要做好常規(guī)防護(hù)措施，以盡量防范和降低內(nèi)外源因子引入或傳播的風(fēng)險。供者組織獲取、儲存、運(yùn)輸和入廠檢驗(yàn)等步驟應(yīng)經(jīng)過充分研究，制定完善的追溯系統(tǒng)，明確標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程和關(guān)鍵質(zhì)量控制參數(shù)，并完成必要的驗(yàn)證。供者組織入廠時，根據(jù)工藝要求、產(chǎn)品特點(diǎn)，應(yīng)進(jìn)行組織類型、數(shù)量、微生物等方面的檢測或確認(rèn)。

供者組織中細(xì)胞的分離工藝可能對干細(xì)胞產(chǎn)品質(zhì)量有影響。研究分離工藝時，建議采用具有代表性的供者來源組織，處理過程中關(guān)注細(xì)胞鑒別、活率及生長活性、外源致病微生物和干細(xì)胞特性檢測（如細(xì)胞表面標(biāo)志物群、表達(dá)產(chǎn)物和分化潛能等）等關(guān)鍵質(zhì)量特性。供者組織分離獲得的原代細(xì)胞和直接采集到的供者細(xì)胞入廠時，或經(jīng)過初步擴(kuò)增后，根據(jù)工藝要求、產(chǎn)品特點(diǎn)，應(yīng)對細(xì)胞類型、數(shù)量、表型、活力、微生物、誘導(dǎo)分化潛能等方面進(jìn)行相應(yīng)的檢測，如細(xì)胞類型可通過相關(guān)的生物標(biāo)志物（蛋白、基因）進(jìn)行鑒定和確認(rèn)。標(biāo)志物陽性（或陰性）的細(xì)胞比例可以作為預(yù)期細(xì)胞群或非目的細(xì)胞群指標(biāo)評估的依據(jù)。

1.1.3 細(xì)胞建系與建庫

為了保證產(chǎn)品批間一致性和穩(wěn)定性，建議生產(chǎn)過程中盡量建庫生產(chǎn)。建議參考ICH《Q5D：用于生物技術(shù)產(chǎn)品及生物制品生產(chǎn)的細(xì)胞基質(zhì)的來源和鑒定》、中國藥典《生物制品生產(chǎn)檢定用動物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程》，并結(jié)合細(xì)胞特性和生產(chǎn)需求，對適合的生產(chǎn)用細(xì)胞和細(xì)胞種子（Cell Seed）進(jìn)行建系、建庫和檢定等。對于人胚干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，尤其是基因修飾多能干細(xì)胞應(yīng)篩選建立單克隆細(xì)胞株，并建立細(xì)胞庫。

細(xì)胞建庫應(yīng)在符合現(xiàn)行《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》的條件下制備。商業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模的建庫頻率依據(jù)產(chǎn)品自身特性和批產(chǎn)量等確定。對于需要從多個供者取材建庫的情形，如臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)品，為了保證細(xì)胞庫內(nèi)和細(xì)胞庫間的質(zhì)量均一性，應(yīng)特別關(guān)注供者材料的質(zhì)量一致性。對于需在多能干細(xì)胞階段建庫的情形，如異體 ESCs/iPSCs 來源干細(xì)胞產(chǎn)品，應(yīng)對細(xì)胞庫進(jìn)行全面的檢定。ESCs/iPSCs 細(xì)胞庫檢定內(nèi)容一般包括細(xì)胞形態(tài)、鑒別、活性、標(biāo)志物，細(xì)胞干性/多能性（如多能性基因 OCT4、SOX2、NANOG 等檢測，三胚層方向的分化標(biāo)志物檢測、畸胎瘤試驗(yàn)）、分化潛能，微生物學(xué)安全性、雜質(zhì)殘留、遺傳穩(wěn)定性（染色體穩(wěn)定性如核型或數(shù)字核型分析、全基因組測序、全外顯子測序）和表觀遺傳學(xué)研究等。對于基因修飾多能干細(xì)胞單克隆庫的情形，需結(jié)合全基因組測序等方法進(jìn)行細(xì)胞庫基因組穩(wěn)定性評估，并對細(xì)胞庫進(jìn)行修飾基因的功能的驗(yàn)證和安全性分析。除基因物質(zhì)的轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)染方式和效率研究不適用外，其他相關(guān)要求可適當(dāng)參考“三、一般考慮”章節(jié)中“（六）基因修飾細(xì)胞的研究”部分。對于不適合建庫生產(chǎn)的情形，如自體基因修飾造血干細(xì)胞產(chǎn)品，應(yīng)提供充分的依據(jù)，說明確保產(chǎn)品批間一致性的質(zhì)量控制策略。

1.1.4 傳代穩(wěn)定性

干細(xì)胞在傳代過程中可能不穩(wěn)定，產(chǎn)生異質(zhì)性細(xì)胞，且高代次干細(xì)胞可能具有安全性風(fēng)險，因此無論是建庫干細(xì)胞還是非建庫干細(xì)胞，均須對傳代穩(wěn)定性進(jìn)行充分、規(guī)范的研究。建議以群體倍增水平（PDL）定義細(xì)胞代次，或明確細(xì)胞傳代過程中的群體倍增時間（PDT）以開展研究。

傳代穩(wěn)定性研究的條件應(yīng)能代表實(shí)際臨床/商業(yè)化生產(chǎn)工藝，重點(diǎn)關(guān)注遺傳穩(wěn)定性、成瘤/致瘤性、細(xì)胞干性、多能性、目的細(xì)胞分化能力等，并根據(jù)研究制定并明確體外生產(chǎn)限傳代次和臨床使用代次。傳代穩(wěn)定性的研究項(xiàng)目一般包括細(xì)胞形態(tài)、STR 鑒別、活率、活細(xì)胞數(shù)、群體倍增時間、表型等生長特性穩(wěn)定性，也包括染色體核型和組學(xué)測序等遺傳穩(wěn)定性，還包括多能性基因表達(dá)、畸胎瘤形成、定向誘導(dǎo)分化等干性的穩(wěn)定性。

1.2 生產(chǎn)輔助細(xì)胞

生產(chǎn)過程中若使用輔助細(xì)胞（如病毒包裝細(xì)胞、飼養(yǎng)層細(xì)胞），應(yīng)充分說明其使用的必要性與合理性。輔助細(xì)胞應(yīng)符合來源清晰可追溯、安全性風(fēng)險可控、建立細(xì)胞庫分級管理的基本原則。需對輔助細(xì)胞來源、培養(yǎng)和建系/庫過程清楚溯源，對引入外源因子或免疫原性等的風(fēng)險進(jìn)行分析評估和檢測控制。輔助細(xì)胞的添加量和殘留量，應(yīng)進(jìn)行研究與驗(yàn)證，對于其中可能涉及細(xì)胞失活處理的工藝，如輻照或添加藥物等，需證明不會對產(chǎn)品造成安全性和功能方面的影響。輔助細(xì)胞可進(jìn)行建庫管理，并按藥典細(xì)胞庫檢驗(yàn)要求進(jìn)行全面檢驗(yàn)，建議特別關(guān)注對人源/動物源病毒的檢驗(yàn)。應(yīng)結(jié)合輔助細(xì)胞的特性和功能等，考察不同代次的輔助細(xì)胞庫細(xì)胞的穩(wěn)定性。

1.3 體外基因修飾系統(tǒng)

對于直接經(jīng)體外基因修飾獲得的干細(xì)胞產(chǎn)品，或者經(jīng)重編程技術(shù)獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（利用人成體細(xì)胞起始，通過外源基因表達(dá)、化合物誘導(dǎo)、表觀遺傳修飾等途徑來獲得人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）后再衍生所得的干細(xì)胞產(chǎn)品，其上游生產(chǎn)多涉及體外基因修飾系統(tǒng)，基因修飾系統(tǒng)（含病毒包裝細(xì)胞）的設(shè)計(jì)、制備和質(zhì)量控制等藥學(xué)專業(yè)技術(shù)要求可參考《體外基因修飾系統(tǒng)藥學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》。 

2. 其他原材料

需充分考慮原材料使用的科學(xué)性和安全性，以及大規(guī)模生產(chǎn)時的持續(xù)可及性。

生產(chǎn)中使用的原材料應(yīng)有明確的來源、組成、用途、用量和質(zhì)量控制等，具備原材料來源證明、檢驗(yàn)報告書、包裝說明書、TSE/BSE風(fēng)險分析等文件。建議優(yōu)先選擇質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)級別高、風(fēng)險等級低的原材料，若生產(chǎn)中使用研究級試劑（如培養(yǎng)基、細(xì)胞因子、化學(xué)小分子等），為了確保產(chǎn)品一致性和純度，應(yīng)盡可能按照GMP 要求生產(chǎn)。如果對未按照GMP生產(chǎn)的試劑是否具備足夠高的質(zhì)量應(yīng)用于人體存在疑問，應(yīng)有足夠的研究資料去除這種疑問。細(xì)胞制備過程中不得使用青霉素等 β-內(nèi)酰胺類抗生素。對于可能影響產(chǎn)品安全性的原材料，若經(jīng)評估對產(chǎn)品安全性無影響，需在最終產(chǎn)品或生產(chǎn)的合適階段對殘留進(jìn)行評估和控制，并結(jié)合臨床使用劑量確定需要控制的殘留限度。有些高風(fēng)險原材料可能需要單獨(dú)開展動物體內(nèi)的安全性評估。

（二）輔料

    輔料相關(guān)要求請見“五、生產(chǎn)工藝”章節(jié)中“（一）工藝開發(fā) 2.2 輔料”部分。

（三）接觸性耗材、容器和藥械組合

接觸性耗材、容器是指生產(chǎn)過程中與工藝中間品直接接觸的耗材和容器（一次性管路、細(xì)胞工廠、生物反應(yīng)袋、濾器等）。需結(jié)合產(chǎn)品特點(diǎn)開展適用性和生物安全性評估，并進(jìn)行相關(guān)研究。藥械組合產(chǎn)品需關(guān)注各組件與樣品的相互作用和風(fēng)險，以及組件對干細(xì)胞產(chǎn)品功能的影響。

五、生產(chǎn)工藝

    干細(xì)胞產(chǎn)品類型多樣，不同細(xì)胞類型，其制備工藝的內(nèi)容和流程也有所不同。應(yīng)盡量遵循藥品生產(chǎn)工藝的一般規(guī)律，應(yīng)用質(zhì)量源于設(shè)計(jì)的理念，關(guān)注對生產(chǎn)工藝與產(chǎn)品質(zhì)量關(guān)系的研究，加強(qiáng)對雜質(zhì)去除的研究與驗(yàn)證，建立穩(wěn)健可靠的生產(chǎn)工藝。

（一）工藝開發(fā)

干細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)工藝一般包括上游的原液工藝和下游的制劑工藝。工藝流程一般包括細(xì)胞的獲取、復(fù)蘇、傳代或擴(kuò)增、激活或預(yù)處理、基因修飾、誘導(dǎo)分化、純化、收獲、灌裝、凍存、運(yùn)輸?shù)榷鄠€工藝步驟。原液和制劑的界限有的時候可能并不清晰，需要根據(jù)產(chǎn)品情況適當(dāng)劃分。通過工藝開發(fā)和工藝表征，逐步明確生產(chǎn)工藝步驟、工藝參數(shù)及其限定范圍（尤其是關(guān)鍵工藝參數(shù) CPP 和主要工藝參數(shù) KPP）、生產(chǎn)過程控制、可接受標(biāo)準(zhǔn)和廢棄標(biāo)準(zhǔn)等，明確生產(chǎn)規(guī)模和批次、批量的定義，關(guān)注上下游工藝規(guī)模的匹配性，保證工藝相對穩(wěn)定可靠。原則上按藥品開發(fā)的人源干細(xì)胞產(chǎn)品不建議進(jìn)行合批。若采用縮小模型用于工藝研究，應(yīng)對縮小模型的代表性進(jìn)行確認(rèn)。

1. 原液工藝

原液工藝開發(fā)的重點(diǎn)可能在于細(xì)胞培養(yǎng)工藝、誘導(dǎo)分化工藝、基因修飾和其他工藝，以及純化工藝。生產(chǎn)工藝的設(shè)計(jì)應(yīng)能避免細(xì)胞發(fā)生非預(yù)期或異常的變化，并能滿足去除相關(guān)雜質(zhì)和具備相應(yīng)功能的要求。

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)工藝

干細(xì)胞產(chǎn)品的質(zhì)量特性一般在細(xì)胞培養(yǎng)階段形成，長期培養(yǎng)會面臨一定的風(fēng)險，比如：（1）體外培養(yǎng)細(xì)胞存在被病原體污染的風(fēng)險。(2)細(xì)胞培養(yǎng)過程中，長時間傳代可能會導(dǎo)致突變累積、基因組和表觀遺傳不穩(wěn)定，從而改變細(xì)胞分化能力或功能，特別是因?yàn)樽儺惖募?xì)胞可能會在培養(yǎng)中存在生長優(yōu)勢。因此,工藝開發(fā)過程中應(yīng)嚴(yán)格選擇合適的培養(yǎng)體系（培養(yǎng)基和添加因子）、培養(yǎng)方式，準(zhǔn)確控制培養(yǎng)時間和培養(yǎng)代次。比如，開發(fā)非飼養(yǎng)層細(xì)胞擴(kuò)增工藝,采用懸浮培養(yǎng)、基于微載體的三維培養(yǎng)法用于大規(guī)模擴(kuò)增，以及采用有傳代穩(wěn)定性研究支持的傳代代次內(nèi)的干細(xì)胞制備終產(chǎn)品。

1.2 誘導(dǎo)分化工藝

通過誘導(dǎo)分化，細(xì)胞應(yīng)具備相應(yīng)的細(xì)胞生物學(xué)特征，以支持臨床擬應(yīng)用的功能。在定向誘導(dǎo)分化過程中，需結(jié)合干細(xì)胞的發(fā)育或分化進(jìn)程，引導(dǎo)或調(diào)控干細(xì)胞變?yōu)楣δ芗?xì)胞。為有效控制干細(xì)胞發(fā)生非目標(biāo)分化，需采用合理的分化誘導(dǎo)劑或適當(dāng)?shù)姆只种苿┨岣叨ㄏ蚍只?。生產(chǎn)工藝應(yīng)能對不同分化階段的細(xì)胞命運(yùn)進(jìn)行有效調(diào)控，控制終末細(xì)胞不再發(fā)生非預(yù)期的分化或轉(zhuǎn)分化。對各階段細(xì)胞群的組成、純度、干性、多能性、分化潛能、標(biāo)志物表達(dá)、生物學(xué)功能（分化能力和細(xì)胞因子分泌譜）等可選擇在合理的分化節(jié)點(diǎn)進(jìn)行監(jiān)測。

1.3 基因修飾和其他工藝

一些工藝策略，如基因修飾、細(xì)胞激活或預(yù)處理，可能有助于增強(qiáng)干細(xì)胞終產(chǎn)品的期望的生物學(xué)活性。其中，通過基因修飾啟動或過表達(dá)特定治療活性蛋白，可增強(qiáng)特殊治療功能。細(xì)胞因子刺激、化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)、物理方式干預(yù)（如低氧處理）等，可提高免疫調(diào)控功能。采取這些工藝策略時，應(yīng)進(jìn)行相關(guān)的細(xì)胞功能驗(yàn)證，并充分評估引入的安全性風(fēng)險。

1.4 純化工藝

純化工藝的目的在于最大限度地提高純度，即提高具有特定表型的細(xì)胞與總細(xì)胞的比值，減少最終細(xì)胞產(chǎn)品中的非目的細(xì)胞和其他雜質(zhì)。應(yīng)對純化工藝進(jìn)行開發(fā)研究和工藝表征，對各純化步驟和純化工藝參數(shù)的純化效率和收率進(jìn)行評估。

由于非目的細(xì)胞成分復(fù)雜，其可能是來自不同或同一譜系的細(xì)胞，分化不完全的細(xì)胞，或不需要的細(xì)胞，如未分化的干細(xì)胞，純度分析時應(yīng)加強(qiáng)對工藝中間品各組分的分析鑒定，盡可能完整地明確各成分的性質(zhì)，分析非目的細(xì)胞的特性。

2. 制劑工藝

2.1 制劑處方

劑型的選擇需考慮產(chǎn)品的臨床應(yīng)用、儲存和運(yùn)輸?shù)姆€(wěn)定性和安全性等因素。處方的設(shè)計(jì)和篩選需與劑型相適應(yīng)，并能有效維持產(chǎn)品的活性和穩(wěn)定性。根據(jù)研究，確定最終制劑和使用方式，如確定是新鮮細(xì)胞還是凍存細(xì)胞，是游離細(xì)胞形式還是與基質(zhì)結(jié)合，是凍存細(xì)胞復(fù)蘇后直接給藥還是經(jīng)洗滌等工藝處理后再給予患者等。同時，還需明確處方組成，制劑規(guī)格、細(xì)胞濃度等。

2.2 輔料

通過風(fēng)險評估，并經(jīng)充分的處方篩選研究和驗(yàn)證，證明選用輔料的科學(xué)性和安全性，并明確輔料的來源、質(zhì)量和用量。輔料的使用應(yīng)符合藥典要求。建議盡量選擇低風(fēng)險的輔料，盡量選用藥用級輔料。當(dāng)使用新型輔料時應(yīng)參考相關(guān)指南開展適當(dāng)?shù)姆桥R床安全性研究。

2.3 制劑生產(chǎn)工藝

制劑生產(chǎn)工藝需結(jié)合產(chǎn)品特點(diǎn)、處方、劑型等研究確定，工藝開發(fā)過程中，可應(yīng)用質(zhì)量源于設(shè)計(jì)的理念，關(guān)注處方的配制方式、工藝操作時間、灌裝準(zhǔn)確度、無菌條件控制等。如制劑需要凍存，應(yīng)開展制劑的凍存和復(fù)蘇工藝研究，鼓勵采用帶有在線監(jiān)測的程序降溫先進(jìn)設(shè)備開展不同降溫程序研究。對于冷凍保存或以其他方式儲存的產(chǎn)品，應(yīng)確定短期或者長期儲存對產(chǎn)品活性和穩(wěn)定性的影響。

3. 工藝過程控制

干細(xì)胞產(chǎn)品復(fù)雜，產(chǎn)品質(zhì)量難以完全精確表征，可應(yīng)用質(zhì)量源于設(shè)計(jì)的理念，加強(qiáng)工藝過程控制。為了控制產(chǎn)品的批間質(zhì)量一致，可對干細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)的全過程進(jìn)行合理的過程控制，包括明確的工藝參數(shù)和中控標(biāo)準(zhǔn)，以確保其質(zhì)量(一致性、純度和效力)和安全性。這些工藝參數(shù)包括特定步驟的培養(yǎng)條件（溫度、溶氧、pH、CO2）、工藝添加劑的用量、生產(chǎn)中每個環(huán)節(jié)的時間控制范圍，等等。同時，可在合理的工藝節(jié)點(diǎn)進(jìn)行工藝中間品檢測，檢測與產(chǎn)品質(zhì)量相關(guān)的工藝性能指標(biāo)，如細(xì)胞形態(tài)、活力、表型特征(包括預(yù)期和非預(yù)期細(xì)胞群)、生物負(fù)荷、回收率等，并設(shè)置可接受標(biāo)準(zhǔn)，為糾偏限度提供依據(jù)。由于干細(xì)胞產(chǎn)品一般無法進(jìn)行終端除菌和除病毒工藝，外源因子污染風(fēng)險高，生產(chǎn)過程中應(yīng)在適當(dāng)環(huán)節(jié)檢測微生物安全性指標(biāo)（包括無菌、支原體、內(nèi)毒素等）。

（二）工藝變更

干細(xì)胞產(chǎn)品的變更，可參考一般生物制品的可比性研究的基本原則，但由于干細(xì)胞產(chǎn)品的復(fù)雜性和異質(zhì)性，現(xiàn)有的藥學(xué)表征方法很難全面反映變更前后產(chǎn)品質(zhì)量（安全性、有效性）的差異。在干細(xì)胞產(chǎn)品的開發(fā)和上市后變更中，可能需要更多借助非臨床和臨床研究手段。

對于干細(xì)胞產(chǎn)品，不能僅靠終產(chǎn)品的檢測來說明變更前后產(chǎn)品質(zhì)量的可比性，變更研究的內(nèi)容應(yīng)該覆蓋變更前后的原材料比對、工藝過程比對、工藝中間品與終產(chǎn)品的質(zhì)量屬性比對，以及穩(wěn)定性比對等，其中質(zhì)量屬性比對應(yīng)該著重關(guān)注鑒別、生物學(xué)活性以及純度和雜質(zhì)等。全面識別各類變更對產(chǎn)品安全性、有效性、質(zhì)量可控性的潛在影響，科學(xué)合理地制定變更策略和研究方案?？梢詤⒖?/span> ICH Q5E 的基本原則，設(shè)置合理的可比性研究取樣點(diǎn)、檢測指標(biāo)及可接受標(biāo)準(zhǔn)，選用變更前后工藝生產(chǎn)的代表性批次進(jìn)行可比性研究，關(guān)注檢測項(xiàng)目的全面性、預(yù)設(shè)對比研究標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置的合理性、檢測方法的有效性和檢測結(jié)果分析的客觀性等。隨著研發(fā)的進(jìn)展，研發(fā)過程中可能存在多個階段不同的生產(chǎn)工藝，如非注冊臨床工藝、非臨床工藝、臨床工藝、商業(yè)化生產(chǎn)工藝、上市后變更的新工藝等，應(yīng)具體分析各階段工藝之間的差異，研究各工藝版本下的產(chǎn)品質(zhì)量是否可橋接，如有必要，應(yīng)進(jìn)一步提供非臨床或人體比對研究數(shù)據(jù)。一般情況下，在確證性臨床試驗(yàn)開展前，建議完成所有預(yù)期變更。

（三）工藝驗(yàn)證

為了持續(xù)生產(chǎn)出質(zhì)量一致的干細(xì)胞產(chǎn)品，進(jìn)行切實(shí)可行的工藝驗(yàn)證十分關(guān)鍵。

經(jīng)過工藝驗(yàn)證后，生產(chǎn)中所有原材料和工藝嚴(yán)格遵循質(zhì)量控制體系和標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。

工藝驗(yàn)證時，需采用商業(yè)化生產(chǎn)產(chǎn)能下的生產(chǎn)工藝，進(jìn)行連續(xù)多個批次干細(xì)胞產(chǎn)品的生產(chǎn)，關(guān)注起始原材料等對產(chǎn)品質(zhì)量的影響。商業(yè)化工藝驗(yàn)證自體產(chǎn)品時，應(yīng)關(guān)注同時同階段最大產(chǎn)能的挑戰(zhàn)研究，考慮人員、設(shè)備、物料、環(huán)境、檢測等整體運(yùn)行能力對生產(chǎn)產(chǎn)能的支持能力，還應(yīng)著重考慮干細(xì)胞的體外擴(kuò)增能力、代次和分化效率、產(chǎn)品純度對商業(yè)化生產(chǎn)產(chǎn)能的支持能力。應(yīng)詳細(xì)記錄工藝驗(yàn)證中，不同批次工藝性能和產(chǎn)品質(zhì)量的變化情況，全面確認(rèn)生產(chǎn)工藝的穩(wěn)健性和產(chǎn)品質(zhì)量的一致性，驗(yàn)證關(guān)鍵生產(chǎn)階段樣品的鑒別、微生物安全性、純度和生物學(xué)活性，評估基因組穩(wěn)定性等，確保產(chǎn)品的安全性。

考慮到生產(chǎn)工藝對生產(chǎn)終末細(xì)胞的影響，需對可傳代的終產(chǎn)品進(jìn)行傳代穩(wěn)定性研究和驗(yàn)證，建議重點(diǎn)關(guān)注限傳代次下的生長特性穩(wěn)定性、遺傳穩(wěn)定性、成瘤/致瘤性考察以及終末細(xì)胞分化和去分化情況分析等。

在輸入人體前，干細(xì)胞產(chǎn)品到達(dá)醫(yī)療機(jī)構(gòu)的運(yùn)輸方式、在醫(yī)院的使用方法（如復(fù)蘇、洗滌等）、處理時間和儲存條件、期限等也應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證。在臨床回輸操作中，重點(diǎn)關(guān)注防范不同類型細(xì)胞自身特點(diǎn)所引起的風(fēng)險（如細(xì)胞失活、聚團(tuán)、喪失干性等），以及臨床使用過程中微生物污染的風(fēng)險。對于新型給藥裝置和給藥方式，需驗(yàn)證給藥準(zhǔn)確度。

六、質(zhì)量研究與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

（一）質(zhì)量研究

由于干細(xì)胞產(chǎn)品具有多樣性、異質(zhì)性、復(fù)雜性、特殊性、進(jìn)展性等特性，因此對干細(xì)胞產(chǎn)品的質(zhì)量研究應(yīng)全面且持續(xù)，建議選擇代表性的生產(chǎn)批次（如非臨床研究批次、臨床試驗(yàn)批次、商業(yè)化生產(chǎn)批次）和合適的生產(chǎn)階段樣品（例如原代細(xì)胞或細(xì)胞種子、細(xì)胞庫、工藝中間品、原液和制劑成品等）進(jìn)行研究。質(zhì)量研究內(nèi)容可結(jié)合細(xì)胞特性進(jìn)行選擇，盡量覆蓋細(xì)胞特性分析、理化特性分析、純度和雜質(zhì)分析、安全性分析和生物學(xué)活性分析等方面，盡可能采用一系列先進(jìn)、正交的分析技術(shù)，且分析方法應(yīng)經(jīng)過研究確認(rèn)，確保方法適用可靠。

1. 細(xì)胞特性分析  

細(xì)胞形態(tài)：形態(tài)學(xué)分析可能對細(xì)胞的生長分化狀態(tài)具有一定的指示作用，可結(jié)合各種成像技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察，幫助確定細(xì)胞的狀態(tài)。

細(xì)胞鑒別：建議從細(xì)胞的表型或遺傳型等多種維度，采用種屬鑒別和細(xì)胞譜系等多種方法對細(xì)胞進(jìn)行鑒別，鼓勵開發(fā)能鑒別潛在污染細(xì)胞的方法，控制生產(chǎn)過程中細(xì)胞交叉污染的風(fēng)險。

細(xì)胞活性：干細(xì)胞產(chǎn)品通常是活的細(xì)胞治療產(chǎn)品，可通過細(xì)胞活率、活細(xì)胞數(shù)、群體倍增時間(PDT)、細(xì)胞周期等對細(xì)胞活性進(jìn)行綜合評價。   

生物標(biāo)志物：多種表面標(biāo)志物可對細(xì)胞類型、多能性、譜系、終末分化和/ 或功能進(jìn)行表征，常采用相關(guān)分析檢測方法如蛋白免疫印跡（Western Blot,WB）、流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光等，進(jìn)行細(xì)胞特性分析。mRNA 標(biāo)記物與蛋白質(zhì)標(biāo)記物表達(dá)的有效相關(guān)性如果經(jīng)驗(yàn)證，可使用基于 mRNA 的標(biāo)記物輔助進(jìn)行細(xì)胞表征。

2. 理化特性分析     一般理化特性分析需結(jié)合產(chǎn)品類型和制劑特征開展研究，常包括外觀、顏色、 pH 值、明顯可見異物、滲透壓摩爾濃度、裝量等項(xiàng)目。

3. 純度和雜質(zhì)分析

干細(xì)胞產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中，可能會引入或產(chǎn)生非細(xì)胞雜質(zhì)（如理化雜質(zhì)）、細(xì)胞碎片或非目的細(xì)胞，影響產(chǎn)品純度，并可能帶來安全性風(fēng)險，因此需要根據(jù)產(chǎn)品類型和工藝特點(diǎn)，進(jìn)行全面規(guī)范的純度和雜質(zhì)研究。通常純度分析的研究項(xiàng)目可能包括：活細(xì)胞比例、細(xì)胞群或亞群比例、目的細(xì)胞比例和非目的細(xì)胞比例等。經(jīng)研究，當(dāng)非目的細(xì)胞對產(chǎn)品安全性和有效性無不良影響時，需研究其組成和比例，盡量控制批間一致性。

雜質(zhì)分析的研究項(xiàng)目包括工藝相關(guān)雜質(zhì)和產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)。工藝相關(guān)雜質(zhì)是指生產(chǎn)過程中引入的雜質(zhì)，如殘留的外源蛋白、抗生素、誘導(dǎo)試劑、微載體、病毒載體、DNA 等。產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)如非目的細(xì)胞、細(xì)胞非預(yù)期表達(dá)的產(chǎn)物、死細(xì)胞殘留、細(xì)胞碎片和其他可能的降解產(chǎn)物等。對于這些影響產(chǎn)品安全性的雜質(zhì)成分，應(yīng)在工藝中予以去除，在質(zhì)量研究中予以檢測，并進(jìn)行定性/定量控制。需要特別關(guān)注的是，產(chǎn)品中可能存在高風(fēng)險雜質(zhì)成分的情況下（如 ESC 或 iPSC 殘留），應(yīng)當(dāng)建立和明確雜質(zhì)去除方法及雜質(zhì)殘留的定量檢測方法。如果雜質(zhì)成分不能有效去除，則應(yīng)當(dāng)在動物模型或其他系統(tǒng)中進(jìn)行安全性和毒性評估，并根據(jù)人體暴露最大劑量或體內(nèi)安全性研究結(jié)果，設(shè)定安全合理的殘留限度。

4. 安全性分析

4.1 生物學(xué)安全性：包括由干細(xì)胞產(chǎn)品自身生物學(xué)特性所決定的和誘發(fā)受者體內(nèi)其他細(xì)胞生物學(xué)特性發(fā)生改變相關(guān)的安全性問題。在對干細(xì)胞生物學(xué)安全性進(jìn)行評估時，應(yīng)考慮相關(guān)細(xì)胞的臨床適應(yīng)癥、給藥途徑、劑量等與臨床治療直接相關(guān)的因素，并利用合適的體內(nèi)、體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯ο嚓P(guān)的生物學(xué)安全性進(jìn)行有效評估。干細(xì)胞生物學(xué)安全性包括成瘤性和致瘤性、非預(yù)期分化、脫靶編輯等。

成瘤性（Tumorigenicity）、致瘤性（Oncogenicity）：藥學(xué)方面應(yīng)考慮干細(xì)胞產(chǎn)品的成瘤和致瘤風(fēng)險，特別是高代次的，或經(jīng)過體外復(fù)雜處理和基因修飾的干細(xì)胞產(chǎn)品?；诙嗄芨杉?xì)胞所具有的三胚層分化潛能及其潛在的致畸胎瘤特性，對于 ESCs 和 iPSCs 來源的干細(xì)胞衍生產(chǎn)品，應(yīng)特別關(guān)注終產(chǎn)品成瘤性和致瘤性檢測。軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)、端粒酶活性檢測可一定程度上體外表征產(chǎn)品的成瘤性。

非預(yù)期分化：干細(xì)胞在體外操作過程中可能分化為非目的細(xì)胞。建議開發(fā)特定的檢測技術(shù)（比如高通量測序），研究、評估和監(jiān)控干細(xì)胞產(chǎn)品非預(yù)期分化的可能性和影響，可結(jié)合目的細(xì)胞分化效率進(jìn)行具體分析。脫靶編輯：應(yīng)用基因組編輯技術(shù)可能會帶來不同程度的非目的基因組編輯風(fēng)險，出現(xiàn)染色體不穩(wěn)定和脫靶編輯（如 DNA 插入或刪除）等情況。對干細(xì)胞進(jìn)行基因組編輯的產(chǎn)品，應(yīng)分析和研究基因修飾細(xì)胞中的脫靶編輯情況，建議使用包括無偏全基因組分析在內(nèi)的多重正交方法（例如，計(jì)算機(jī)、生化、細(xì)胞分析方法）識別潛在的脫靶位點(diǎn)。

4.2 微生物學(xué)安全性：由于干細(xì)胞產(chǎn)品缺少滅菌工藝和去病毒步驟，應(yīng)在原材料和生產(chǎn)工藝環(huán)節(jié)中對微生物安全性風(fēng)險進(jìn)行控制，具體可參考藥典要求和其他有關(guān)藥品的控制策略。微生物學(xué)安全性具體是指：干細(xì)胞產(chǎn)品應(yīng)當(dāng)不存在各種微生物（細(xì)菌、真菌、支原體和病毒等）、微生物代謝產(chǎn)物/衍生物（如細(xì)菌內(nèi)毒素）等的污染。病毒污染包括種屬特異性病毒（如人源/動物源病毒）、內(nèi)外源逆轉(zhuǎn)錄病毒以及其他非特定病毒，應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特性于工藝的適當(dāng)階段進(jìn)行相關(guān)檢測，綜合生產(chǎn)全過程評估產(chǎn)品的病毒污染風(fēng)險。對于逆轉(zhuǎn)錄病毒和非特定病毒因子檢測，可參考《中國藥典》三部通則“生物制品生產(chǎn)檢定用動物細(xì)胞基質(zhì)制備及質(zhì)量控制”的相關(guān)要求進(jìn)行。對于使用復(fù)制缺陷型等病毒載體獲得的干細(xì)胞產(chǎn)品，應(yīng)在產(chǎn)品設(shè)計(jì)和質(zhì)量研究時充分考慮控制病毒載體回復(fù)突變的風(fēng)險，復(fù)制型病毒（replication competent virus, RCV）的檢測要求參考相關(guān)指導(dǎo)原則。

5. 生物學(xué)活性分析

干細(xì)胞產(chǎn)品是活細(xì)胞藥物，其生物學(xué)作用可能是多靶點(diǎn)、多通路的，且不同類型的干細(xì)胞產(chǎn)品具有不同的生物學(xué)功能。因此，需要基于產(chǎn)品與臨床相關(guān)的治療活性或預(yù)期的生物學(xué)效應(yīng)，開發(fā)能夠代表產(chǎn)品作用機(jī)制的定量生物學(xué)活性/功能測定方法，多活性組分產(chǎn)品應(yīng)當(dāng)分別進(jìn)行鑒定和活性測定。

有時還需開發(fā)干細(xì)胞生物學(xué)活性的替代指標(biāo)，如在活體系統(tǒng)之外進(jìn)行的理化分析測定法（physicochemical analytical assay），通過評估產(chǎn)品的免疫化學(xué)、生物化學(xué)和/或分子屬性來提供廣泛的產(chǎn)品表征數(shù)據(jù)。采用的分析測定法應(yīng)開展替代方法與活性相關(guān)性研究，還應(yīng)證明該測定法可以區(qū)分活性產(chǎn)品與非活性或降解形式的產(chǎn)品，并進(jìn)行充分的對照研究和方法學(xué)驗(yàn)證。有些干細(xì)胞產(chǎn)品具有復(fù)雜的和 /或不完全清晰的作用機(jī)理或具有多種生物學(xué)活性，細(xì)胞生物學(xué)功能表征須結(jié)合體外生物學(xué)效應(yīng)和體內(nèi)動物模型綜合評價。干細(xì)胞產(chǎn)品技術(shù)進(jìn)展和認(rèn)知更新較快，生物學(xué)活性分析需結(jié)合產(chǎn)品特點(diǎn)與時俱進(jìn)。比如目前來看，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的生物學(xué)活性主要包括誘導(dǎo)分化功能、免疫調(diào)控功能和組織再生功能，其中誘導(dǎo)分化功能包括成骨、成脂、成軟骨細(xì)胞的分化功能檢測，而免疫調(diào)控功能可通過檢測免疫調(diào)控因子等來表征。再如，ESCs/iPSCs衍生細(xì)胞的生物學(xué)活性是基于分化細(xì)胞特殊的生物學(xué)功能的檢測，或與分化細(xì)胞功能相關(guān)的特定基因和蛋白質(zhì)的檢測。另外，干細(xì)胞生物學(xué)活性檢測可能還涉及到細(xì)胞定向分化效率檢測、細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)/結(jié)構(gòu)的形成、細(xì)胞相互作用（如免疫激活或抑制）、細(xì)胞的遷移分化或自我更新潛能評估等等。

（二） 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立主要包括以下過程：確定質(zhì)量研究的內(nèi)容、進(jìn)行方法學(xué)研究、確定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的項(xiàng)目及限度、制訂及修訂質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。干細(xì)胞產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)采用經(jīng)驗(yàn)證的分析方法，評估產(chǎn)品的鑒別、純度、無菌性和活性，應(yīng)體現(xiàn)干細(xì)胞產(chǎn)品的質(zhì)量特點(diǎn)。

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的項(xiàng)目及限度結(jié)合質(zhì)量研究和產(chǎn)品特點(diǎn)確定，限度的設(shè)定應(yīng)能確保產(chǎn)品的安全性、有效性和批間一致性。干細(xì)胞產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目一般包括：細(xì)胞鑒別、細(xì)胞活性（細(xì)胞活率、活細(xì)胞數(shù)、功能細(xì)胞數(shù)、群體倍增時間）、純度（如目的細(xì)胞比例）、生物學(xué)活性（如分化效率、定量/半定量功能測定、標(biāo)志物）、產(chǎn)品和工藝相關(guān)雜質(zhì)、成瘤性/致瘤性（如適用）、非預(yù)期分化、微生物安全性（無菌、內(nèi)毒素、支原體、內(nèi)外源病毒）、一般檢測（外觀、pH 值、明顯可見異物、滲透壓摩爾濃度、裝量）等。如細(xì)胞產(chǎn)品曾接受基因修飾，應(yīng)對每批終產(chǎn)品基因修飾目的細(xì)胞的百分比、單個細(xì)胞的平均載體或質(zhì)?？截悢?shù)、目的基因及其表達(dá)產(chǎn)物的功能、脫靶編輯、轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)染用載體的殘留量等進(jìn)行控制。對于使用復(fù)制缺陷型病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，應(yīng)證明不存在復(fù)制型載體（RCV）。對于運(yùn)輸?shù)结t(yī)院后需要進(jìn)行給藥前再操作（比如容器的轉(zhuǎn)換、物理狀態(tài)的轉(zhuǎn)變、與其他結(jié)構(gòu)材料的聯(lián)合、過濾與清洗等）的干細(xì)胞產(chǎn)品，需模擬實(shí)際操作開展臨床使用相關(guān)研究，根據(jù)研究結(jié)果明確給藥前的操作步驟和注意事項(xiàng)，并向醫(yī)院提供完善的產(chǎn)品信息和操作培訓(xùn)資料，包括針對操作步驟的復(fù)核和標(biāo)簽核對等。使用前檢查必須至少包含外觀、顏色、鑒別和包裝完整性等檢測。方法學(xué)研究包括方法的選擇和方法的驗(yàn)證。干細(xì)胞產(chǎn)品方法學(xué)研究中需關(guān)注的特殊要求，比如：（1）在細(xì)胞基質(zhì)鑒定和檢測中使用更先進(jìn)方法和技術(shù)改進(jìn)時，應(yīng)開展新舊方法的全面對比驗(yàn)證和檢測橋接研究，證明新方法的專屬性、靈敏度和精密度至少與現(xiàn)有方法相當(dāng)。（2）有關(guān)生物標(biāo)志物的分析方法驗(yàn)證應(yīng)規(guī)范開展，特別關(guān)注陽性對照的設(shè)計(jì)與驗(yàn)證。（3）需盡可能采取多種正交的分析檢測方法進(jìn)行生物學(xué)活性測定研究，并完成方法學(xué)驗(yàn)證。方法研究中還應(yīng)考慮活性組分之間潛在的非累加效應(yīng)，例如干擾效應(yīng)或協(xié)同效應(yīng)。（4）干細(xì)胞產(chǎn)品可能包含異質(zhì)性的細(xì)胞群，需采用盡可能敏感的方法定量檢測與生物學(xué)活性相關(guān)的目的細(xì)胞和非目的細(xì)胞群，方法研究時應(yīng)特別關(guān)注對照的設(shè)置與驗(yàn)證。（5）原則上應(yīng)依據(jù)現(xiàn)行版藥典中的生物制品無菌和支原體檢查法進(jìn)行干細(xì)胞終產(chǎn)品的放行檢測，必要時采用快速方法放行應(yīng)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證?？焖俜椒?yàn)證時需參考相關(guān)指導(dǎo)原則,充分考慮選用代表性污染陽性對照品。在未能充分驗(yàn)證新型方法可以完全替代藥典傳統(tǒng)方法時，建議在使用新型檢測方法進(jìn)行放行檢測的同時，開展藥典傳統(tǒng)方法的平行檢測，同時對檢測結(jié)果后置可能出現(xiàn)的非預(yù)期結(jié)果制定處置方案?？焖俜椒☉?yīng)逐步完成與藥典方法的比對，以證明檢測能力不低于藥典法。（6）對于經(jīng)基因修飾的干細(xì)胞產(chǎn)品，如果從最終產(chǎn)品中去除了外源遺傳物質(zhì)，需開發(fā)相關(guān)的高靈敏檢測方法進(jìn)行確認(rèn)。

分析檢測方法中可能使用參比品/對照品，鼓勵開發(fā)建立細(xì)胞參比品用于干細(xì)胞產(chǎn)品的質(zhì)量控制。用于分析的參比品/對照品需具備代表性和可溯源性，應(yīng)采用經(jīng)驗(yàn)證的分析檢測方法對其進(jìn)行充分的特性分析，并鑒定合格。需完成參比品/對照品標(biāo)定（含量標(biāo)定和活性標(biāo)定），并對產(chǎn)品開發(fā)各個階段使用的參考品開展穩(wěn)定性研究，確定復(fù)驗(yàn)期和有效期。

七、穩(wěn)定性研究

在開展干細(xì)胞產(chǎn)品的穩(wěn)定性研究時，可參考生物制品的穩(wěn)定性研究的技術(shù)要求，如 ICH Q5C 和生物制品穩(wěn)定性研究技術(shù)指導(dǎo)原則。

穩(wěn)定性研究的目的是為干細(xì)胞產(chǎn)品的儲存、運(yùn)輸和使用提供支持。研究內(nèi)容一般包括影響因素試驗(yàn)（溫度、光照、機(jī)械力等）、加速試驗(yàn)、長期試驗(yàn)、運(yùn)輸試驗(yàn)和臨床使用中穩(wěn)定性試驗(yàn)。試驗(yàn)樣品一般包括代表性原液（如有）、成品和需要臨時或階段性凍存的工藝中間品，研究用樣品的生產(chǎn)、使用和質(zhì)量（如總細(xì)胞密度和體積范圍等） 應(yīng)可代表實(shí)際情況。試驗(yàn)條件應(yīng)充分考慮新鮮細(xì)胞和凍存細(xì)胞的區(qū)別，考慮干細(xì)胞產(chǎn)品保存、包裝、運(yùn)輸、臨床配伍和實(shí)際給藥的特殊要求，考慮各個環(huán)節(jié)樣品累積的儲存時間對最終產(chǎn)品穩(wěn)定性的影響等。試驗(yàn)項(xiàng)目應(yīng)能充分反映考察條件對質(zhì)量的影響，如細(xì)胞活率和活細(xì)胞數(shù)等細(xì)胞特性、生物學(xué)活性、細(xì)胞純度、理化特性、微生物安全性指標(biāo)以及關(guān)鍵輔料含量等。

申報臨床階段的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)應(yīng)能夠支持臨床試驗(yàn)開展，即穩(wěn)定性研究的期限應(yīng)至少能夠涵蓋所開展的臨床試驗(yàn)的要求，證明產(chǎn)品從放行至患者給藥的有效期是合理的。申報上市時需提供多個代表性批次的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)以支持和確定貯藏條件、使用條件和有效期，同時應(yīng)明確產(chǎn)品的敏感條件、細(xì)胞狀態(tài)或質(zhì)量隨時間的變化情況等。

八、包裝及密封容器系統(tǒng)

包裝及密封容器系統(tǒng)的適用性評估對象是指直接接觸產(chǎn)品的包裝容器和密封系統(tǒng)。應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品給藥途徑（靜脈給藥、局部給藥、眼用制劑等）、制劑性質(zhì)（新鮮細(xì)胞、凍存制劑等）等，選擇合適的內(nèi)包材（凍存管、西林瓶、軟袋等）。應(yīng)對直接接觸的包裝材料和密封容器的功能性和相容性進(jìn)行研究，功能性研究比如密封性、耐低溫性，相容性研究可參考相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則開展。  

九、名詞解釋

成體干細(xì)胞（Adult stem cells，ASCs）：源自已經(jīng)發(fā)育的胚胎組織、成人組織（如牙齒來源、脂肪來源等）或出生伴隨的附件組織（如臍帶、胎盤）的未分化細(xì)胞，可自我更新，并且具有向一種或多種終末功能細(xì)胞分化的潛能。如間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）、造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell, HSC）、神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell，NSC)、皮膚干細(xì)胞 （keratinocyte stem cell, KSC）等。

人胚干細(xì)胞（Embryonic stem cells,ESCs）：源自人著床前胚胎中未分化的初始細(xì)胞，其體外培養(yǎng)期限自受精或核移植開始不得超過14天，可在體外無限制地自我更新，并且具有向三胚層細(xì)胞分化的潛能。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs）：由人體細(xì)胞經(jīng)重編程而獲得的具有無限自我更新能力和向三胚層細(xì)胞分化潛能的一種干細(xì)胞，具有類似于人胚干細(xì)胞的多能性。

轉(zhuǎn)分化（Transdifferentiation）：體細(xì)胞或成體干細(xì)胞通過基因修飾、化學(xué)誘導(dǎo)等方法，不經(jīng)過多能干細(xì)胞狀態(tài)，直接轉(zhuǎn)化為不同胚層或不同譜系其他體細(xì)胞或干細(xì)胞的過程。

畸胎瘤（Teratoma）：一種含有三胚層的分化組織和細(xì)胞的良性腫瘤?？茖W(xué)界常通過注射干細(xì)胞到免疫功能缺陷的小鼠體內(nèi)的方法,驗(yàn)證所產(chǎn)生的畸胎瘤包含三個胚層細(xì)胞?？捎糜诖_定是否建立了人胚干細(xì)胞系或人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系。

飼養(yǎng)層細(xì)胞（Feeder layer cell）：通過細(xì)胞-細(xì)胞相互作用或分泌一定營養(yǎng)物質(zhì)，用于支持其他細(xì)胞生長、擴(kuò)增的細(xì)胞。

十、 參考文獻(xiàn)

[1] 國家食品藥品監(jiān)督管理總局. 細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則(試行). 2017.

[2] 國家藥典委員會. 《中華人民共和國藥典》(2020 年版)[M]. 2020.

[3] 國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會與國家食品藥品監(jiān)督管理總局. 干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則(試行). 2015.

[4] 衛(wèi)生部. 人的體細(xì)胞治療及基因治療臨床研究質(zhì)控要點(diǎn). 1993.

[5] 衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2000] 184 號《臨床輸血技術(shù)規(guī)范》.

[6] 科技部和衛(wèi)生部. 人胚胎干細(xì)胞研究倫理指導(dǎo)原則. 2003.

[7] 衛(wèi)生部. 涉及人的生物醫(yī)學(xué)研究倫理審查辦法. 2016.

[8] 國家食品藥品監(jiān)督管理局. 藥物臨床試驗(yàn)倫理審查工作指導(dǎo)原則.2010.

[9] ISSCR Guidelines for Stem Cell Research and Clinical Translation.2021.

[10] FDA. Guidance for FDA Reviewers and Sponsors. Content and Review of Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Somatic Cell Therapy Investigational New Drug Applications (INDs). 2008.

[11] FDA. Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs). 2020.

[12] FDA. Deviation Reporting for Human Cells,Tissues,and Cellular and Tissue-based Products Regulated Solely Under Section 361 of the Public Health Service Act and 21CFR Part 1271. 2017.

[13] FDA《Guidance for Industry；Potency Tests for Cellular and Gene Therapy Products》. 2011.

[14] EMA. Reflection paper on stem cell-based medicinal products. 2011.

[15] PMDA. ヒト ES 細(xì)胞加工醫(yī)薬品等の品質(zhì)及び安全性の確保について. 2012.

[16] ICH Guidance on Quality of Biotechnological/Biological Products: Derivation and Characterization of Cell Substrates Used for Production of Biotechnological/Biological Products, (63 FR 50244, September 21, 1998).

[17] ICH. Q5E Comparability of  Biotechnological/Biological Products Subject to Changes in Their Manufacturing Process. 2004.

[18] ICH. Q5C Stability Testing of Biotechnological and Biological Products.1995.