基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)藥學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則

（征求意見稿）

國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心

生物制品藥學(xué)部

2020年9月

目 錄 

一、前言

二、范圍

三、風(fēng)險控制

四、目的基因及調(diào)控元件

五、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)

（一）病毒載體類基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)

1、病毒載體包裝系統(tǒng)的設(shè)計與構(gòu)建

2、生產(chǎn)用原材料

3、生產(chǎn)工藝

4、質(zhì)量研究與質(zhì)量控制

（二）核酸類基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)

1、分子設(shè)計和上游構(gòu)建

2、生產(chǎn)用原材料

3、生產(chǎn)工藝

4、質(zhì)量研究與質(zhì)量控制

六、穩(wěn)定性研究

七、內(nèi)包材研究

八、工藝變更

九、環(huán)境和生物安全性

十、名詞解釋

十一、參考文獻(xiàn)

一、前言

近年來，免疫細(xì)胞治療和基因編輯等基礎(chǔ)理論、技術(shù)手段蓬勃發(fā)展，相關(guān)臨床醫(yī)療探索不斷深入，為嚴(yán)重和難治性疾病提供了新的治療理念和方法。新興治療產(chǎn)品日益增加的臨床需求促進(jìn)了遺傳物質(zhì)導(dǎo)入、傳遞和表達(dá)等基因操作新技術(shù)和新工具的應(yīng)用和更新?；蜣D(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)指含有工程化基因構(gòu)建體的載體或遞送系統(tǒng)，可有效地將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入特定靶細(xì)胞，用于修飾靶細(xì)胞的遺傳物質(zhì)、改變基因表達(dá)方式或調(diào)節(jié)細(xì)胞生物特性等。細(xì)胞和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)發(fā)展迅速，種類多樣，且基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)設(shè)計和制備過程的差異可導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量的顯著差異。CAR-T細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞等不同類別細(xì)胞治療產(chǎn)品（ex vivo）的生產(chǎn)過程常涉及離體細(xì)胞的基因改造或修飾，所用的各類基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)需經(jīng)過完整的安全性、有效性和質(zhì)量可控性評價，其藥學(xué)研究與直接應(yīng)用于人體的基因治療產(chǎn)品（in vivo）存在差異。為滿足細(xì)胞治療產(chǎn)品基因操作的需要，規(guī)范和指導(dǎo)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)的藥學(xué)研發(fā)，特制定本技術(shù)指導(dǎo)原則。本指導(dǎo)原則僅基于當(dāng)前的科學(xué)認(rèn)知，對基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)的藥學(xué)研究提出一般性技術(shù)要求。隨著基因治療技術(shù)的發(fā)展、認(rèn)知的深入和經(jīng)驗的積累，后續(xù)將逐步修訂和完善相關(guān)技術(shù)要求。

本指導(dǎo)原則是針對基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)的建議性的技術(shù)要求，旨在為藥品注冊申請人（以下簡稱申請人）的研發(fā)、申報提供指導(dǎo)意見，同時，也作為監(jiān)管機(jī)構(gòu)監(jiān)管和評價細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)用基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)的重要參考。按照藥品注冊的基因修飾后細(xì)胞治療產(chǎn)品，其生產(chǎn)時使用的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)作為關(guān)鍵材料，需接受國家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）的監(jiān)管，研發(fā)和申報時在遵循本指導(dǎo)原則的同時，還應(yīng)符合《中華人民共和國藥品管理法》、《藥品注冊管理辦法》、《中華人民共和國藥典》等相關(guān)法律法規(guī)的要求，同時綜合參考其他相關(guān)指導(dǎo)原則，以及后續(xù)發(fā)布的關(guān)于該領(lǐng)域的相關(guān)法規(guī)。對具體問題的適用性，應(yīng)具體問題具體分析。

二、范圍

本指導(dǎo)原則所涉及基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)，指擬在輸入受試者或病人之前，直接對細(xì)胞的遺傳物質(zhì)進(jìn)行修飾、改變基因表達(dá)方式或調(diào)節(jié)細(xì)胞生物特性所用的含有工程化基因構(gòu)建體的載體或遞送系統(tǒng)，可能包括病毒載體、非病毒載體，以及特異性的基因編輯工具等。其通過將外源基因?qū)氚屑?xì)胞或組織，替代、補(bǔ)償、阻斷、修正特定基因，以達(dá)到治療疾病的目的?？赡艿淖饔脵C(jī)制包括細(xì)胞內(nèi)表達(dá)編碼功能性蛋白的轉(zhuǎn)基因，或采用基因沉默、外顯子跳躍、基因敲除、基因調(diào)控、核苷酸編輯等方式修復(fù)、添加或刪除特定的基因序列等。

本指導(dǎo)原則中的病毒載體類基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)包括：（1）慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒等常見細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)用病毒載體；除上述常用的病毒載體外，其他具有基因遞送功能的病毒載體如皰疹病毒、牛痘病毒、EB病毒、柯薩奇病毒等的藥學(xué)研究也可參考本指導(dǎo)原則。（2）非病毒類基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)，包括DNA、RNA、轉(zhuǎn)座子載體、基于染色體的載體，并可能采用脂質(zhì)體、陽離子多聚糖等助轉(zhuǎn)試劑及電轉(zhuǎn)等方式進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)；特異性基因編輯工具包括基于 CRISPR-Cas、鋅指核酸酶（ZFN）或TALEN等系統(tǒng)的序列特異性核酸內(nèi)切酶和序列特異性核酸修飾酶。

本指導(dǎo)原則中基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)擬修飾的細(xì)胞治療產(chǎn)品，指經(jīng)過生產(chǎn)工藝處理的活細(xì)胞治療產(chǎn)品，包括終末分化的體細(xì)胞和具有分化潛能的干細(xì)胞治療產(chǎn)品等。對人類生殖細(xì)胞或人類胚胎進(jìn)行任何形式的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)的應(yīng)用不在本指導(dǎo)原則適用范圍之內(nèi)。

三、風(fēng)險控制

與基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)相關(guān)的風(fēng)險因素取決于載體以及所使用的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒，也取決于要進(jìn)行基因修飾的細(xì)胞群。典型風(fēng)險因素包括但不限于：載體的染色體整合潛力及其染色體整合程度、載體免疫原性、載體潛伏/再激活和/或動員的能力及其重組/混種潛力以及非靶點(diǎn)的生物分布情況。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞后，可能激活位于前病毒 DNA 整合位點(diǎn)附近的內(nèi)源性 DNA 序列。另外，載體是否具有復(fù)制能力以及在經(jīng)相應(yīng)野生型或輔助病毒互補(bǔ)后產(chǎn)生回復(fù)突變或意外復(fù)制的能力也是重要的風(fēng)險因素。此外，風(fēng)險因素也與治療性轉(zhuǎn)基因表達(dá)或任何其他遞送的轉(zhuǎn)基因表達(dá)量以及表達(dá)持續(xù)時間相關(guān)。對改變表觀遺傳、基因表達(dá)水平等，但不對基因組本身進(jìn)行編輯的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)，應(yīng)根據(jù)系統(tǒng)作用機(jī)理，全面分析脫靶相關(guān)的風(fēng)險因素，并設(shè)計體外和體內(nèi)實(shí)驗開展研究，闡明相關(guān)檢測系統(tǒng)的科學(xué)性等。

基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)依據(jù)載體工具的不同，可分為病毒載體類基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)、核酸類基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)等；依據(jù)復(fù)制能力的不同，可分為非復(fù)制型、條件復(fù)制型、復(fù)制型基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)；依據(jù)載體在靶細(xì)胞基因組中整合能力的不同，可分為非整合型、定點(diǎn)整合型、弱整合型、隨機(jī)整合型等不同類型。基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾的作用機(jī)制包括同源重組、非同源重組等。因此，需要根據(jù)多方面因素、針對不同類型產(chǎn)品的特性進(jìn)行風(fēng)險評估和控制。應(yīng)通過綜合風(fēng)險分析來論證產(chǎn)品開發(fā)的合理性和科學(xué)性，識別、確定與產(chǎn)品質(zhì)量和安全性相關(guān)的風(fēng)險因素；確定非臨床和臨床研究期間所需進(jìn)行風(fēng)險評估的數(shù)據(jù)范圍和重點(diǎn)，并制定風(fēng)險防控和處理措施。申請人需在整個產(chǎn)品生命周期內(nèi)對其進(jìn)行跟蹤分析和更新，收集數(shù)據(jù)以進(jìn)一步確定其風(fēng)險特征并制定控制策略。

本指導(dǎo)原則的適用情形，按照細(xì)胞治療產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝特點(diǎn)，可分為細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)或修飾后建立細(xì)胞庫和不建立細(xì)胞庫兩類情形，兩類細(xì)胞產(chǎn)品應(yīng)用基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)的風(fēng)險不同，相應(yīng)藥學(xué)研究的要求存在差異。本指導(dǎo)原則主要適用于采用基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)改造后的細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞傳代、擴(kuò)增等操作制備細(xì)胞治療產(chǎn)品再進(jìn)行人體回輸?shù)那樾?，該情形下所用的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)為高風(fēng)險系統(tǒng)。對于基因轉(zhuǎn)導(dǎo)或修飾細(xì)胞之后建立細(xì)胞庫再用于細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)的情形，若單克隆細(xì)胞篩選、細(xì)胞庫建立檢定和傳代穩(wěn)定性等方面進(jìn)行了深入研究，早期所用的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)及修飾系統(tǒng)相對風(fēng)險較低，該情形下，可適當(dāng)降低相關(guān)生產(chǎn)用原材料、生產(chǎn)工藝、質(zhì)量研究與質(zhì)量控制、穩(wěn)定性和內(nèi)包材等方面的藥學(xué)研究要求。

四、目的基因及調(diào)控元件

目的基因：目的基因指載體運(yùn)輸、傳遞、表達(dá)的遺傳物質(zhì)，是基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)發(fā)揮作用的關(guān)鍵元件，因此建議結(jié)合其在疾病治療中的作用或作用機(jī)理謹(jǐn)慎設(shè)計和選用基因序列，主要包括關(guān)注目的基因的來源、序列篩選及優(yōu)化過程，明確完整的核苷酸、氨基酸序列信息，并建議與數(shù)據(jù)庫收錄的相關(guān)序列進(jìn)行序列比對。對于新型改構(gòu)目的基因，應(yīng)闡述分子改構(gòu)的科學(xué)評估及驗證研究考慮，如人源化改構(gòu)，敲減元件，自殺標(biāo)記，防止高級結(jié)構(gòu)形成、為適應(yīng)載體遞送能力進(jìn)行的序列改造和刪減等。建議結(jié)合非臨床研究分析目的基因或其表達(dá)產(chǎn)物與靶分子的特異性結(jié)合能力，評估目的基因或其表達(dá)產(chǎn)物潛在的非特異性效應(yīng)、免疫原性等。

調(diào)控元件：功能性元件對目的基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)具有重要調(diào)控作用，建議關(guān)注其設(shè)計原理并進(jìn)行確認(rèn)研究。建議明確信號肽、轉(zhuǎn)錄啟動子、增強(qiáng)子、5’UTR、 3’UTR、PolyA、增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯效率相關(guān)元件、選擇性標(biāo)記、復(fù)制起始位點(diǎn)、額外引入的基因序列等的來源及選擇依據(jù)，明確完整的帶注釋的序列信息。質(zhì)粒構(gòu)建時應(yīng)避免使用β-內(nèi)酰胺類抗生素抗性基因。

目的基因表達(dá)常用的啟動子包括CMV、EF1ɑ、PGK等，也存在可調(diào)控基因表達(dá)的開關(guān)式啟動子如Tet-On、Tet-off等，還有為增強(qiáng)靶細(xì)胞目的基因表達(dá)能力使用組織特異性啟動子等。RNA的表達(dá)一般用III類啟動子啟動，如H1、hU6等。建議結(jié)合靶細(xì)胞類型、目的基因表達(dá)時間和表達(dá)量的需求、啟動子的人用經(jīng)驗等分析其啟動子使用的安全性，在風(fēng)險評估的基礎(chǔ)上合理選用，如使用來自巨細(xì)胞病毒的強(qiáng)啟動子CMV時曾發(fā)現(xiàn)與之相關(guān)的高腫瘤發(fā)生率。若對功能元件進(jìn)行了任何序列改構(gòu)或優(yōu)化（如刪除部分序列、密碼子優(yōu)化），均應(yīng)詳細(xì)提供序列更改的依據(jù)與安全性考慮。建議關(guān)注功能元件設(shè)計對細(xì)胞基因組內(nèi)源性基因的干擾，比如終止子、隔離子等元件的設(shè)計。例如為降低安全風(fēng)險，建議整合型基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)設(shè)計時對土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件WPRE進(jìn)行改構(gòu)。

五、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)

（一）病毒載體類基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)

1、病毒載體包裝系統(tǒng)的設(shè)計與構(gòu)建

病毒載體按照基因組性質(zhì)可分為單鏈或雙鏈的 DNA 病毒、RNA 病毒等類型，按照結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可分為有包膜、無包膜等類型。建議對病毒載體基因組性質(zhì)進(jìn)行研究，包括單鏈、雙鏈、自身互補(bǔ)的DNA或RNA，以及每個病毒顆粒的基因組拷貝數(shù)等。建議關(guān)注病毒載體的結(jié)構(gòu)組成以及對結(jié)構(gòu)的所有修飾（如對抗體結(jié)合位點(diǎn)或趨向性改變元件的修飾等）。應(yīng)采用所有可能的手段降低與野生型病毒相關(guān)的任何致病性，并將病毒重組和回復(fù)突變的風(fēng)險降到最低。若屬新的或改變結(jié)構(gòu)的病毒載體，須關(guān)注親本病毒的來源、培養(yǎng)歷史和生物學(xué)特性等，對組建的材料、方法、組建步驟及鑒定進(jìn)行充分研究。對病毒載體的改構(gòu)不應(yīng)引入新的安全風(fēng)險。對于選擇性感染某種器官/組織的病毒載體，建議研究插入基因或相應(yīng)報告基因在目標(biāo)器官/組織的選擇性表達(dá)情況。

γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（Retroviral Vector）：γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒可反向轉(zhuǎn)錄其RNA 基因組成為DNA拷貝或前病毒，病毒DNA隨機(jī)整合進(jìn)入有絲分裂活躍的細(xì)胞。γ -逆轉(zhuǎn)錄病毒包括鼠白血病病毒（MuLV），貓白血病病毒（FeLV）和長臂猿白血病病毒（GALV）等。采用逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行基因修飾的風(fēng)險包括前病毒序列在靶細(xì)胞基因組中啟動子、增強(qiáng)子序列中的整合引起的致癌風(fēng)險，mRNA 3’端取代導(dǎo)致的細(xì)胞癌基因的異常激活等。早期臨床試驗曾發(fā)現(xiàn)，逆轉(zhuǎn)錄病毒對造血干細(xì)胞進(jìn)行基因改造回輸人體后誘導(dǎo)了腫瘤的發(fā)生。目前對逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的臨床使用安全性仍在探索中，建議謹(jǐn)慎使用γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行分裂活躍的干細(xì)胞類產(chǎn)品的基因編輯。

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體曾通過轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝，后期為防止復(fù)制型病毒的產(chǎn)生，穩(wěn)定整合轉(zhuǎn)基因、輔助基因（gag-pol、env）的穩(wěn)定產(chǎn)毒細(xì)胞株開始廣泛應(yīng)用。為提升包裝系統(tǒng)的安全性，逆轉(zhuǎn)錄病毒穩(wěn)定產(chǎn)毒細(xì)胞株經(jīng)歷了三次優(yōu)化，第一代產(chǎn)毒株刪去了病毒的包裝信號，第二代產(chǎn)毒株對病毒輔助元件進(jìn)行了改構(gòu)，如刪去5’LTR的5’端，替換3’LTR等。第三代產(chǎn)毒株中 gag-pol和env基因分別置于不同轉(zhuǎn)錄單元，對病毒同源序列進(jìn)行了替換（如采用其他病毒序列替換 LTR、使用異源啟動子等）。常見的第三代穩(wěn)定產(chǎn)毒細(xì)胞株包括小鼠NIH/3T3 PG13、HEK293-Phoenix細(xì)胞等不同類型。為調(diào)控病毒親嗜性，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體假病毒的包膜蛋白通常替換為其他包膜蛋白，常見包括 Amphotropic MLV envelope 4070A或10A1、長臂猿白血病病毒包膜蛋白GALV 等。由于第三代穩(wěn)定產(chǎn)毒細(xì)胞株提高了逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝效率、批間質(zhì)量一致性和病毒使用的安全性，使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行人體細(xì)胞治療產(chǎn)品基因修飾時，建議優(yōu)先使用刪除了非必需元件、經(jīng)充分改構(gòu)、安全性級別較高的穩(wěn)定產(chǎn)毒細(xì)胞系生產(chǎn)γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒。

慢病毒載體（Lentiviral Vector）：慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒亞科。慢病毒載體通過介導(dǎo)目的基因整合至非分裂細(xì)胞發(fā)揮作用，其親本病毒包括人靈長類慢病毒（HIV）、非人靈長類和非靈長類慢病毒如猴免疫缺陷病毒（SIV）、貓免疫缺陷病毒（FIV）、馬傳染性貧血病毒（EIAV）、山羊關(guān)節(jié)炎/腦炎病毒（CAEV）和牛Jembrana病毒等。目前尚不清楚人類感染非人靈長類和非靈長類慢病毒的后果，建議使用該類載體時關(guān)注產(chǎn)生重組病毒嵌合體和跨物種傳播的相關(guān)風(fēng)險。

通常慢病毒載體基因組含有載體包裝、逆轉(zhuǎn)錄和載體基因組整合入宿主細(xì)胞基因組所需的順式作用序列。對于HIV衍生的慢病毒載體，為增強(qiáng)載體的趨向性和顆粒穩(wěn)定性，一般用編碼異源病毒包膜蛋白（如VSV-G）的基因替換HIV包膜蛋白來生產(chǎn)假病毒。慢病毒載體包裝系統(tǒng)應(yīng)進(jìn)行復(fù)制缺陷設(shè)計。慢病毒載體生產(chǎn)和臨床使用的主要風(fēng)險點(diǎn)包括：（1）生產(chǎn)過程中可能產(chǎn)生復(fù)制型慢病毒（RCL），（2）載體與慢病毒多核苷酸序列進(jìn)行體內(nèi)重組，（3）在活性基因中或其附近插入前病毒DNA從而可能引起或促進(jìn)腫瘤發(fā)生。因此慢病毒包裝系統(tǒng)設(shè)計方面，建議采用所有可能降低慢病毒致病風(fēng)險的措施，其中包括不同基因應(yīng)分離于不同質(zhì)粒表達(dá)(如gag/pol和rev分離)，降低輔助質(zhì)粒和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒間的序列同源性以防止與人體內(nèi)源性病毒重組，刪除病毒包裝不必要的調(diào)控元件(Tat、Vif、Vpr、Vpu、 Env和Nef)，改構(gòu)長末端重復(fù)序列使得末端自失活(SIN)，利用人類細(xì)胞偏好密碼子合成病毒元件等。對于轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，鼓勵進(jìn)行相關(guān)序列改構(gòu)，降低啟動子插入靶細(xì)胞引起原癌基因活化的幾率。采用慢病毒進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)時，建議選擇含有末端自失活結(jié)構(gòu)、刪去非必需元件、同源序列經(jīng)充分改造、病毒包裝元件拆分于多個質(zhì)粒的慢病毒包裝系統(tǒng)。

腺病毒載體（Adeno Viral Vector）：腺病毒載體是較常見的基因遞送載體，其一般不整合入細(xì)胞染色體，直接進(jìn)行短暫的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。腺病毒載體的早期人體應(yīng)用過程中曾出現(xiàn)細(xì)胞因子風(fēng)暴等嚴(yán)重不良反應(yīng)，因此建議合理選擇腺病毒載體的類別，關(guān)注其免疫原性等安全性風(fēng)險。采用腺病毒進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)時，建議進(jìn)行復(fù)制缺陷設(shè)計（如刪除E1A和E1B基因和部分E3基因序列），并最大程度降低其免疫原性（如刪除E2A、E2B或E4序列等）。此外，建議關(guān)注腺病毒載體序列與細(xì)胞中病毒序列同源重組產(chǎn)生復(fù)制型腺病毒的風(fēng)險。  

腺相關(guān)病毒載體（Adeno-associated Viral Vector）：使用AAV進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的風(fēng)險可能包括復(fù)制型 AAV 相關(guān)的非預(yù)期免疫反應(yīng)、輔助病毒殘留相關(guān)毒性、病毒中和及引入的非預(yù)期安全性風(fēng)險、AAV載體元件與已存在AAV Rep和Cap 序列之間發(fā)生同源或非同源重組事件產(chǎn)生假野生型AAV等。為最大程度降低上述風(fēng)險，建議設(shè)計AAV包裝系統(tǒng)時分析包裝質(zhì)粒序列，如Rep/Cap基因序列和ITR 等序列之間的相似性，并需要針對具體結(jié)構(gòu)設(shè)計進(jìn)行安全性評價。建議包裝時將 AAV 的不同結(jié)構(gòu)基因分離于不同質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄單元中，盡量采用異源啟動子替換 AAV內(nèi)源性啟動子等。一般情況下重組AAV載體基因較少整合到基因組中，但近年來已發(fā)現(xiàn)AAV載體基因整合到特定基因座中導(dǎo)致腫瘤的可能性。建議設(shè)計時充分考慮重組AAV載體的安全性，關(guān)注目的基因的啟動子選擇、給藥劑量、整合區(qū)域等多種相關(guān)因素。

2、生產(chǎn)用原材料

1）細(xì)胞基質(zhì)：選擇用于病毒載體生產(chǎn)的細(xì)胞基質(zhì)時，建議關(guān)注可能影響最終產(chǎn)品安全性的細(xì)胞特征，如是否存在致癌序列等。建議申請人結(jié)合細(xì)胞生長特性和載體生產(chǎn)能力等，說明細(xì)胞株（包括哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等）選擇的考慮。當(dāng)病毒載體與非載體DNA序列（如質(zhì)粒DNA、輔助病毒序列、細(xì)胞DNA等）共同包裝時（如AAV包裝），建議進(jìn)行風(fēng)險評估，謹(jǐn)慎選擇病毒載體生產(chǎn)細(xì)胞基質(zhì)和輔助序列。

包裝/生產(chǎn)病毒載體所用的細(xì)胞基質(zhì)應(yīng)來源清晰，歷史培養(yǎng)情況明確。細(xì)胞基質(zhì)構(gòu)建方面，建議關(guān)注細(xì)胞來源（包括來源物種）、鑒別和生物學(xué)特性，以及是否存在內(nèi)源性病毒顆?；蛐蛄械取?xì)胞基質(zhì)進(jìn)行遺傳修飾時（例如賦予病毒蛋白，允許病毒復(fù)制或包裝），應(yīng)明確遺傳修飾材料，關(guān)注有關(guān)引入遺傳變化的載體質(zhì)量和控制信息。應(yīng)在符合藥品GMP的條件下建立細(xì)胞庫，明確細(xì)胞庫制備、存儲和維護(hù)的信息。

建議結(jié)合細(xì)胞來源和特性，參考《中國藥典》“生物制品生產(chǎn)檢定用動物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程”、ICH Q5A、ICH Q5D等相關(guān)要求進(jìn)行細(xì)胞基質(zhì)和細(xì)胞庫的完整檢定。應(yīng)確保細(xì)胞基質(zhì)無特定物種的病原體。對于人細(xì)胞系，可能需要的檢測包括：HIV-1和2、HBV、HCV、梅毒螺旋體、巨細(xì)胞病毒（CMV）、HTLV-1和 -2、人皰疹病毒6和-8（HHV-6和-8）、Epstein-Barr病毒（EBV）、人細(xì)小病毒 B19、人乳頭瘤病毒（HPV）等。對于其他動物或昆蟲細(xì)胞，建議根據(jù)需要對物種特異性病毒進(jìn)行檢測。例如，對于Vero細(xì)胞，建議申請人檢測猿猴多瘤病毒SV40 和猿猴逆轉(zhuǎn)錄病毒。對于昆蟲細(xì)胞，申請人可以評估易感細(xì)胞系（例如倉鼠腎細(xì)胞（BHK21））是否存在蟲媒病毒。應(yīng)避免使用已知有病毒污染的昆蟲細(xì)胞系。

應(yīng)確保細(xì)胞基質(zhì)和細(xì)胞庫不存在微生物污染，檢測項目應(yīng)包括無菌、支原體（和昆蟲細(xì)胞螺旋體）以及內(nèi)、外源病毒因子的體內(nèi)和體外檢測等。對于已暴露于牛源或豬源成分（例如血清、血清成分、胰蛋白酶）的細(xì)胞系，應(yīng)檢測牛源或豬源外源因子。對于新建立的細(xì)胞系，應(yīng)評估細(xì)胞的成瘤性和致瘤性。

應(yīng)對細(xì)胞庫開展細(xì)胞傳代穩(wěn)定性研究，包括細(xì)胞生長穩(wěn)定性、儲存穩(wěn)定性、遺傳穩(wěn)定性、病毒包裝能力穩(wěn)定性等。建議對生產(chǎn)終末期細(xì)胞（EOP）或具有相似傳代歷史的生產(chǎn)模擬細(xì)胞開展穩(wěn)定性研究，擬定適合生產(chǎn)病毒載體的細(xì)胞的限傳代次。  

2）菌種庫：所有細(xì)菌或微生物（如酵母）的細(xì)胞庫應(yīng)按《中國藥典》相關(guān)規(guī)定或與國際通行要求建立菌種庫系統(tǒng)。菌種庫通常用作生成質(zhì)粒DNA的起始材料，可將其用作基因轉(zhuǎn)移的載體或其他基因治療產(chǎn)品（例如慢病毒載體或AAV 載體）的生產(chǎn)中間體。應(yīng)明確宿主菌的來源、基因型、表型以及目標(biāo)克隆篩選的流程，關(guān)注用于生成菌種庫的材料的歷史和來源，包括有關(guān)如何設(shè)計和構(gòu)建質(zhì)粒載體等。如使用新型菌株，應(yīng)關(guān)注其可能引入的毒素等。

建議明確菌種庫建立、鑒定和檢定的詳細(xì)信息，關(guān)注各級菌種庫的制備規(guī)模、保存條件、擴(kuò)增條件、允許的傳代次數(shù)等。為保證菌種庫無外源因子污染及目的基因序列和其他元件的準(zhǔn)確性，檢測項目應(yīng)包括細(xì)菌形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)物純度、質(zhì)粒限制酶切圖譜、目的基因和其他元件測序等。鼓勵對工程菌活性、質(zhì)粒保有率、鑒別、抗生素抗性等指標(biāo)進(jìn)行檢定。菌種庫傳代穩(wěn)定性研究方面，建議開展菌種遺傳穩(wěn)定性分析（序列大小、序列準(zhǔn)確性、質(zhì)粒限制酶切圖譜、質(zhì)?？截悢?shù)）并明確各級菌種庫的限定傳代代次及依據(jù)。

3）質(zhì)粒：應(yīng)對病毒包裝用各質(zhì)粒的生產(chǎn)工藝開展研究，對各工藝參數(shù)進(jìn)行探索和優(yōu)化，建立穩(wěn)定的質(zhì)粒規(guī)?；a(chǎn)工藝。應(yīng)明確各質(zhì)粒的生產(chǎn)規(guī)模、生產(chǎn)工藝流程，說明相應(yīng)工藝步驟的目的、工藝流程步驟、過程控制策略、物料流轉(zhuǎn)及中間產(chǎn)物等。質(zhì)粒生產(chǎn)過程中應(yīng)避免使用人源和動物源性材料，建議避免使用β-內(nèi)酰胺類抗生素，如需使用，應(yīng)對抗生素的殘留量進(jìn)行控制和安全性評估。需開展完整的質(zhì)粒工藝驗證研究，包括工藝過程控制確認(rèn)、中間體存儲穩(wěn)定性研究、多批次質(zhì)量分析以及雜質(zhì)清除研究等。

質(zhì)粒的質(zhì)量控制建議包括以下項目：pH值、外觀、鑒別（限制性內(nèi)切酶酶切和測序）、質(zhì)粒濃度/含量、純度（A260/A280、超螺旋比例）、宿主菌DNA殘留、宿主菌RNA殘留、宿主蛋白殘留、抗生素殘留（如適用）、無菌/微生物限度及細(xì)菌內(nèi)毒素等。穩(wěn)定性研究方面，建議根據(jù)質(zhì)粒存儲條件開展長期、加速、反復(fù)凍融等影響因素研究，選擇敏感的項目（如超螺旋比例等）進(jìn)行穩(wěn)定性監(jiān)測。

4） 病毒種子庫：病毒種子庫一般用于生產(chǎn)病毒載體，或者可作為生產(chǎn)非復(fù)制病毒載體的輔助病毒。建議關(guān)注病毒種子的來源、歷史培養(yǎng)情況等，明確最終病毒載體和載體中間體的基因圖譜。應(yīng)在藥品GMP條件下建立病毒種子庫，明確種子庫的建立過程、代次、存儲和維護(hù)的信息；如有，應(yīng)說明種子庫制備及衍生過程使用的動物源材料，并進(jìn)行安全性評估。建議說明在病毒種子擴(kuò)增過程中，病毒種子是否經(jīng)噬菌斑純化、有限稀釋純化或從 DNA 或 RNA 克隆中回收等。另外，建議關(guān)注種子庫是否代表單個克隆或病毒變異體或序列的分布。

病毒種子庫應(yīng)經(jīng)過完整檢定，檢測項目建議包括：無菌、支原體以及外源病毒因子的體內(nèi)和體外檢測；細(xì)胞來源的特定病原體，如人類病毒、鼠類/非靈長類動物、禽類、昆蟲病毒等；鑒別病毒載體和治療性轉(zhuǎn)基因（Southern 印跡分析、限制性核酸內(nèi)切酶分析等）；病毒滴度/濃度；均一性；對抗病毒藥物的敏感性（如適用）等。建議對病毒載體進(jìn)行全基因測序，并對預(yù)期序列與測序結(jié)果所有差異的重要性進(jìn)行評估。對于序列長度大于40kb的病毒載體，建議最大程度進(jìn)行序列分析，所分析的序列建議包括基因插入片段、側(cè)翼區(qū)域以及載體中被修飾或可能易于重組的任何區(qū)域等。

應(yīng)對生產(chǎn)用病毒種子開展全面的穩(wěn)定性研究，包括遺傳穩(wěn)定性、目的基因表達(dá)穩(wěn)定性和生產(chǎn)穩(wěn)定性研究等。應(yīng)明確病毒種子庫的限定傳代代次及依據(jù)。如果采用質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)方法進(jìn)行病毒包裝，建議在生產(chǎn)工藝中對一個或多個病毒批次進(jìn)行測序，以確認(rèn)病毒載體序列的穩(wěn)定性。

如病毒載體生產(chǎn)過程使用了輔助病毒，應(yīng)闡明輔助病毒的使用必要性和選擇依據(jù)，結(jié)合科學(xué)認(rèn)知及生產(chǎn)經(jīng)驗說明輔助病毒的安全性。輔助病毒的溯源、設(shè)計構(gòu)建、生產(chǎn)制備、建庫和檢定應(yīng)遵從上述病毒種子庫的一般要求。

5） 其他生產(chǎn)用原材料：包括試劑、培養(yǎng)基、一次性耗材、培養(yǎng)和包裝容器等。原材料的使用應(yīng)參考《中國藥典》“生物制品生產(chǎn)用原材料及輔料的質(zhì)量控制規(guī)程”，具體說明原材料的來源、組分、功能、使用階段、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等，提供相關(guān)的文件（如來源證明、檢驗報告書（COA）、包裝說明書、無TSE/BSE聲明等）證明其符合擬定標(biāo)準(zhǔn)，適用于其預(yù)期用途。生產(chǎn)過程中應(yīng)避免使用人或動物來源的成分，如果必需使用，應(yīng)符合《中國藥典》相關(guān)規(guī)定和/或參照ICH Q5A等技術(shù)指南提供外源因子風(fēng)險評估資料。建議重點(diǎn)提供以下原材料的相關(guān)信息：用于細(xì)胞培養(yǎng)的動物源材料（如牛血清、消化酶），質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑（如氯化鈣、聚乙烯亞胺PEI、陽離子脂質(zhì)等轉(zhuǎn)染試劑），核酸酶，病毒純化過程中使用的緩沖液及純化介質(zhì)、過濾膜等。當(dāng)病毒生產(chǎn)或保存時使用人血白蛋白等血液制品時，應(yīng)盡可能選用藥用級別的材料。  

3、生產(chǎn)工藝

病毒載體的生產(chǎn)全過程應(yīng)當(dāng)符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（GMP）的基本原則和相關(guān)要求?？山Y(jié)合質(zhì)量源于設(shè)計、全生命周期管理和全過程控制等新理念，以及對產(chǎn)品相關(guān)風(fēng)險控制的一般要求開展工藝研究。在對整體工藝的充分理解和對病毒載體產(chǎn)品的累積經(jīng)驗基礎(chǔ)上進(jìn)行工藝設(shè)計，應(yīng)建立規(guī)范的工藝操作步驟、工藝控制參數(shù)和廢棄標(biāo)準(zhǔn)，并明確關(guān)鍵工藝參數(shù)和關(guān)鍵質(zhì)量屬性。應(yīng)對生產(chǎn)的全過程進(jìn)行監(jiān)控，包括生產(chǎn)工藝參數(shù)的監(jiān)測和過程控制指標(biāo)的監(jiān)測等。生產(chǎn)工藝應(yīng)適用于確保成品質(zhì)量符合對應(yīng)開發(fā)階段的質(zhì)量目標(biāo)產(chǎn)品概況（QTPP）要求。另外，應(yīng)采取措施確保病毒載體在生產(chǎn)、儲存、運(yùn)輸?shù)恼麄€過程中未發(fā)生混淆、污染與交叉污染等。

3.1 生產(chǎn)規(guī)模和批次定義

不同類型臨床級病毒載體的生產(chǎn)用細(xì)胞生長特性、病毒產(chǎn)量和穩(wěn)定性等存在較大差異，生產(chǎn)工藝成熟程度及臨床使用劑量等也不盡相同，建議結(jié)合待基因修飾細(xì)胞的特性、病毒載體的生產(chǎn)工藝和治療方案等，合理確定病毒載體的生產(chǎn)規(guī)模。建議盡可能在臨床前采用匹配細(xì)胞產(chǎn)品臨床試驗制備需求的生產(chǎn)工藝規(guī)模生產(chǎn)病毒載體，申報上市階段的病毒生產(chǎn)工藝規(guī)模應(yīng)滿足細(xì)胞治療產(chǎn)品商業(yè)化生產(chǎn)的要求。應(yīng)明確從包裝細(xì)胞培養(yǎng)、收獲、純化形成原液、半成品至病毒載體成品生產(chǎn)批次的定義，包括但不限于生產(chǎn)規(guī)模、包裝細(xì)胞傳代次數(shù)、編號規(guī)則、病毒液合并規(guī)則等。

3.2 工藝開發(fā)

病毒載體可以通過質(zhì)粒DNA瞬時共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞基質(zhì)產(chǎn)生，或通過穩(wěn)定的包裝細(xì)胞系生產(chǎn)，該細(xì)胞系中包含用于病毒包裝的所有必需元件。當(dāng)使用了編碼異源病毒包膜蛋白（例如VSV-G）的質(zhì)粒時，應(yīng)當(dāng)去除包膜基因序列對病毒批次的污染，以消除內(nèi)源或外源病毒假病毒化的風(fēng)險。盡管由于非特異性共包裝，可能無法完全消除，但應(yīng)盡量減少病毒批次中g(shù)ag/pol序列的污染。

病毒載體生產(chǎn)工藝一般分為上游、下游兩個階段，即上游的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞包裝病毒或穩(wěn)定細(xì)胞系生產(chǎn)病毒階段和下游的病毒純化階段。包裝細(xì)胞種類、細(xì)胞培養(yǎng)條件、病毒收獲時間、純化步驟及儲存條件均影響著病毒載體的包裝效率和質(zhì)量。應(yīng)對工藝步驟、關(guān)鍵工藝參數(shù)及其控制范圍進(jìn)行確認(rèn)，并建立相應(yīng)的過程控制檢測標(biāo)準(zhǔn)。生產(chǎn)過程中的中間體可能包括來自收集或保存步驟的材料，例如半成品采集物臨時儲存、濃縮或純化步驟的中間體（色譜柱組分或洗脫液等），應(yīng)提供中間體質(zhì)量和控制的信息。應(yīng)對每個步驟和停留時間進(jìn)行驗證，擬定中間體限度范圍。應(yīng)提供累積的分析數(shù)據(jù)，證明病毒批次的批間質(zhì)量一致性。

3.2.1 γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒的生產(chǎn)工藝研究：

（1） 穩(wěn)定產(chǎn)毒細(xì)胞株構(gòu)建及病毒生產(chǎn)

γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)時常使用穩(wěn)定產(chǎn)毒細(xì)胞株，可采用分別編碼 gag-pol、 env、目的基因的三個質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞并通過細(xì)胞單克隆篩選獲得。穩(wěn)定產(chǎn)毒細(xì)胞株應(yīng)在符合GMP的條件下構(gòu)建及篩選。應(yīng)建立細(xì)胞庫系統(tǒng)，進(jìn)行全面的檢定，開展細(xì)胞傳代穩(wěn)定性研究，關(guān)注不同代次穩(wěn)定產(chǎn)毒細(xì)胞中插入的基因片段的遺傳穩(wěn)定性。

γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)時一般由穩(wěn)定產(chǎn)毒株包裝后分泌至胞外，由于γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒在一般細(xì)胞培養(yǎng)條件下的穩(wěn)定性較弱，生產(chǎn)過程應(yīng)縮短病毒包裝至收獲的時間，可考慮進(jìn)行多次病毒收獲、收獲后立即低溫儲存等策略以確保病毒載體的回收率。病毒生產(chǎn)過程中如使用牛血清等動物原材料，建議對使用的必要性和合理性進(jìn)行充分評估，盡量減少使用量從而降低病毒產(chǎn)品中的雜質(zhì)殘留。

（2） 病毒純化及制劑

由于γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒的包膜蛋白（如包膜蛋白GaLV、4070A等）對層析工藝比較敏感（剪切力），當(dāng)前難以開發(fā)柱層析工藝進(jìn)行純化，通常需要采用經(jīng)驗證的澄清、膜過濾等方法去除收獲液中的包裝細(xì)胞、細(xì)胞碎片等有效純化病毒。為了較大程度去除雜質(zhì)獲得純度較高的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，鼓勵申請人開發(fā)新型層析工藝及裝置，在純化過程中合理選用病毒穩(wěn)定劑等，實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄病毒的規(guī)?；兓?。由于γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒較不穩(wěn)定，應(yīng)關(guān)注病毒制劑處方和保存條件的研究，探索確保病毒滴度穩(wěn)定、抑制病毒聚集產(chǎn)生等的最佳存放條件。

3.2.2慢病毒的生產(chǎn)工藝研究：

（1） 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及病毒包裝

病毒包裝細(xì)胞通常采用貼壁或懸浮方式培養(yǎng)，建議根據(jù)患者群體和目標(biāo)劑量選擇最優(yōu)的滿足商業(yè)化需求的生產(chǎn)平臺。病毒包裝步驟中需對質(zhì)粒濃度、質(zhì)粒比例、轉(zhuǎn)染試劑濃度、誘導(dǎo)試劑濃度（如有）、轉(zhuǎn)染時間、細(xì)胞密度、細(xì)胞培養(yǎng)基組分、細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境（溫度、pH、溶氧）等參數(shù)進(jìn)行研究與優(yōu)化。應(yīng)對工藝步驟、關(guān)鍵工藝參數(shù)及其控制范圍進(jìn)行確認(rèn)，并建立相應(yīng)的過程控制檢測標(biāo)準(zhǔn)，例如在細(xì)胞培養(yǎng)過程中定期檢測細(xì)胞活率和生物負(fù)荷，開展病毒滴度、鑒別、生物負(fù)荷、支原體和外源性病毒等檢測，并采集細(xì)胞建立EOPC用于可復(fù)制型慢病毒（RCL）檢測等。病毒收獲液如需儲存，應(yīng)明確儲存條件、儲存方式并進(jìn)行相關(guān)支持性研究。對于外源因子檢測，應(yīng)最大程度提高檢測的靈敏度，在最有可能檢測到污染的生產(chǎn)階段進(jìn)行檢測。例如應(yīng)當(dāng)在進(jìn)一步加工（澄清、過濾、純化和滅活等步驟）之前，檢測病毒生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物中的外源因子。復(fù)制型慢病毒作為一個重要安全性風(fēng)險關(guān)注點(diǎn)，申請人應(yīng)在制備過程中對病毒（收獲上清液、病毒生產(chǎn)終末期細(xì)胞）采用經(jīng)驗證的指示細(xì)胞培養(yǎng)法完成標(biāo)準(zhǔn)檢測。

（2） 病毒純化及制劑

慢病毒的純化工藝通常采用核酸內(nèi)切酶去除病毒載體中的大片段核酸，經(jīng)澄清、過濾及離子層析或分子排阻色譜等純化步驟進(jìn)行雜質(zhì)的去除，最后經(jīng)制劑、除菌過濾、灌裝、凍存制成病毒載體成品。應(yīng)明確各純化工藝步驟的目的并建立雜質(zhì)譜。應(yīng)對核酸酶濃度、純化方式、介質(zhì)選擇依據(jù)、動態(tài)載量、流速、回收率、病毒制劑處方、灌裝工藝參數(shù)等進(jìn)行研究，并對核酸酶殘留、BSA殘留、風(fēng)險元件殘留（如SV40、E1A元件殘留）、質(zhì)粒DNA殘留、宿主殘留蛋白及宿主殘留DNA 等雜質(zhì)的去除率進(jìn)行研究。需對純化工藝建立過程控制檢測標(biāo)準(zhǔn)，如過程控制項目可以包括生物負(fù)荷、內(nèi)毒素、病毒鑒別、病毒物理滴度、轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度、病毒顆粒完整性等。

3.3 工藝驗證

應(yīng)采用商業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)工藝生產(chǎn)多個批次病毒載體，確認(rèn)各步驟的工藝性能，各批次檢測結(jié)果均應(yīng)符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和過程中控制項目的限度，各批次產(chǎn)品的產(chǎn)量和回收率應(yīng)相對一致，殘留的核酸酶、宿主細(xì)胞蛋白、宿主細(xì)胞DNA、質(zhì)粒DNA、細(xì)胞碎片等雜質(zhì)應(yīng)有效清除至低于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)范圍的水平，以支持病毒載體在定義的正常參數(shù)范圍內(nèi)的生產(chǎn)工藝的穩(wěn)健性和可控性。生產(chǎn)過程中如出現(xiàn)病毒液混批的情況，應(yīng)開展混批前后完整的工藝驗證，并制定混批的原則。另外，應(yīng)完成中間體儲存條件和時間驗證、培養(yǎng)基模擬灌裝驗證、層析柱循環(huán)使用次數(shù)和除菌濾器的驗證以及運(yùn)輸驗證等。對于重組腺相關(guān)病毒等病毒載體，還應(yīng)根據(jù)包裝細(xì)胞類型、純化工藝特點(diǎn)等開展相應(yīng)的病毒滅活/去除驗證。商業(yè)化規(guī)模工藝確認(rèn)后，應(yīng)收集和分析工藝性能和產(chǎn)品質(zhì)量的變化趨勢相關(guān)數(shù)據(jù)，開展持續(xù)工藝驗證。

4、質(zhì)量研究與質(zhì)量控制

4.1 質(zhì)量研究

應(yīng)開展多個代表性批次病毒載體的全面質(zhì)量研究，盡量確保不同批次病毒間工藝、質(zhì)量的一致性。常見的研究項目包括但不限于外觀、鑒別、病毒滴度檢測、純度、生物學(xué)活性、復(fù)制型病毒、風(fēng)險元件殘留、外源因子、雜質(zhì)等。

外觀：如采用目視檢查，應(yīng)由經(jīng)培訓(xùn)的人員對病毒成品進(jìn)行外觀檢查，確保包裝完整未損壞。關(guān)注高濃度病毒載體中是否存在可見異物、不溶性顆粒等。

鑒別：病毒載體的鑒別試驗可從核酸水平和蛋白水平進(jìn)行檢測。核酸方面可采用限制性酶切圖譜分析、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）和核酸序列測定等方法對病毒載體和目的基因進(jìn)行鑒定。應(yīng)對治療序列及涉及調(diào)節(jié)和控制目的基因的序列進(jìn)行完整序列分析，并對預(yù)期序列與實(shí)驗測定序列之間的差異開展充分評估。建議對病毒載體進(jìn)行全基因組測序。另外，也可將病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)目標(biāo)細(xì)胞后，對整合有載體序列的細(xì)胞基因組進(jìn)行測序，說明載體骨架及目的基因序列的準(zhǔn)確性。在蛋白水平可對載體的結(jié)構(gòu)蛋白、表達(dá)產(chǎn)物、蛋白表達(dá)譜、免疫標(biāo)記、表型特征開展分析。鑒別檢測方法開發(fā)時應(yīng)設(shè)置合適的陽性和陰性對照樣品。

整合位點(diǎn)特征：建議研究病毒整合至目標(biāo)細(xì)胞的典型特征，包括優(yōu)勢插入位點(diǎn)、插入拷貝數(shù)、優(yōu)勢克隆異常生長等。關(guān)注癌基因附近是否存在優(yōu)先整合情況及潛在的致癌風(fēng)險。

病毒滴度檢測：病毒滴度作為工藝過程監(jiān)控和產(chǎn)品載體濃度的放行檢測至關(guān)重要，應(yīng)選擇靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度高的檢測方法開展病毒物理滴度（病毒總顆粒數(shù)）和轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度（病毒感染性顆粒數(shù)）的檢測。應(yīng)使用標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌穪硇?zhǔn)病毒滴度檢測結(jié)果。鼓勵申請人采用不同方法進(jìn)行病毒滴度的檢測，并探索不同方法檢測數(shù)值的相關(guān)性。

物理滴度：對于HIV-1衍生的慢病毒載體，常用ELISA方法檢測載體樣本中的p24蛋白從而進(jìn)行物理滴度的檢測，檢測結(jié)果可以顆粒數(shù)/ml表示。此外，載體基因組RNA拷貝數(shù)的定量也可用于載體顆粒數(shù)量的估計，檢測時建議關(guān)注外源 DNA的污染。若采用新技術(shù)檢測病毒顆粒數(shù)，如病毒計數(shù)儀法、納米顆粒跟蹤分析法、場流分離-多角度激光光散射法等，應(yīng)關(guān)注方法對待測病毒類型的適用性。

轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度：可使用基于細(xì)胞的體外檢測方法檢測成功進(jìn)入、接觸并整合入檢測細(xì)胞的功能顆粒的比例。通常待測病毒載體感染檢測用細(xì)胞一定時間后，通過細(xì)胞基因組提取及定量 PCR、流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測轉(zhuǎn)基因整合、表達(dá)的水平，從而計算出病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度，檢測結(jié)果通常以轉(zhuǎn)導(dǎo)單位TU/ml、噬斑形成單位（PFU）、中位組織培養(yǎng)感染劑量（TCID₅₀）等表示。檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度時應(yīng)關(guān)注轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平來自未整合的病毒載體基因的可能性。

建議控制病毒載體產(chǎn)品中總顆粒對感染性顆粒的比例，用于比較不同載體批次之間和載體生產(chǎn)的不同階段之間載體顆粒的功能性/感染性。例如，腺病毒載體目前要求總顆粒數(shù)和感染性滴度的比值不大于30：1，從而控制活病毒所占比例到達(dá)一定的要求。

感染復(fù)數(shù)（MOI）是轉(zhuǎn)染時需要達(dá)到特定轉(zhuǎn)染效率的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)單位（TU）與所修飾細(xì)胞數(shù)量之比。應(yīng)根據(jù)對應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)品的目標(biāo)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，探索商業(yè)化規(guī)模細(xì)胞生產(chǎn)工藝最優(yōu)的MOI。

病毒純度和雜質(zhì)：

純度：應(yīng)采用靈敏的方法研究病毒載體產(chǎn)品的純度，包括高效液相色譜、SDS-PAGE、紫外吸收光譜法等。

產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)：與病毒載體產(chǎn)品相關(guān)的典型雜質(zhì)可能包括錯誤包裝顆粒、缺陷干擾顆粒、非感染性顆粒、空衣殼顆粒、聚集體或復(fù)制型重組病毒污染物。應(yīng)對產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)進(jìn)行深入的分析和檢測，應(yīng)鑒定具有缺失、重排、雜交或突變序列的載體等相關(guān)雜質(zhì)，可以以含量比率的形式報告檢測數(shù)值，必要時應(yīng)納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

工藝相關(guān)雜質(zhì)：檢測項目包括但不限于殘留宿主細(xì)胞蛋白、外源核酸序列、輔助病毒污染物（傳染性病毒、病毒DNA、病毒蛋白等）和生產(chǎn)工藝中所使用的試劑，例如細(xì)胞因子、生長因子、抗體、選擇性磁珠、核酸酶、血清和溶劑等。

殘留核酸，包括與病毒載體共純化的殘留宿主DNA、質(zhì)粒DNA等，是常見的工藝相關(guān)雜質(zhì)。轉(zhuǎn)染過程中病毒載體的衣殼內(nèi)部也可能包裝大質(zhì)粒DNA序列以及包裝細(xì)胞DNA，這些雜質(zhì)可能對產(chǎn)品質(zhì)量和安全性產(chǎn)生不利影響，建議申請人優(yōu)化生產(chǎn)工藝，以減少產(chǎn)品中非載體DNA的污染，必要時應(yīng)對共包裝外來DNA序列進(jìn)行確認(rèn)。此外，申請人應(yīng)監(jiān)測和控制產(chǎn)品中無關(guān)核酸序列的含量。

某些包裝細(xì)胞還可能攜帶致癌基因序列或逆轉(zhuǎn)錄病毒序列，建議申請人最大程度降低任何殘留DNA的生物學(xué)活性，例如減小DNA序列的大小、減少殘留DNA 含量等。建議申請人將非致瘤細(xì)胞的殘留DNA限度定為小于10 ng/劑，并且將DNA片段大小范圍限定為200個堿基對以下。

如果病毒包裝細(xì)胞為腫瘤來源的細(xì)胞（例如HeLa細(xì)胞）、致瘤細(xì)胞系或其他需特別關(guān)注特征的細(xì)胞（例如HEK293T細(xì)胞），除了控制宿主細(xì)胞DNA含量和大小外，還應(yīng)控制載體產(chǎn)品中相關(guān)轉(zhuǎn)化序列的含量，設(shè)置可接受的標(biāo)準(zhǔn)范圍來限制患者暴露量。例如，采用HEK293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒生產(chǎn)時，應(yīng)采用具有足夠的靈敏度和特異性的方法檢測腺病毒E1和SV40大T抗原序列的殘留量。

采用復(fù)制缺陷型或條件復(fù)制型病毒載體時，應(yīng)在生產(chǎn)工藝的適當(dāng)階段檢測生產(chǎn)過程中可能產(chǎn)生的具有復(fù)制能力的病毒、親本病毒或野生型病毒進(jìn)行檢測，并根據(jù)給藥劑量等確定殘留量的標(biāo)準(zhǔn)限度。建議參考相關(guān)原則或文獻(xiàn)收載的專屬性強(qiáng)，精確度、靈敏度較高的檢測方法，建立與研發(fā)階段相適應(yīng)的復(fù)制型病毒檢測方法（RCL、RCR、RCA、rcAAV等），并進(jìn)行完整驗證。常見的檢測方法包括指示細(xì)胞培養(yǎng)法、直接qPCR法等，待測樣品包括病毒生產(chǎn)過程中收獲的病毒上清、生產(chǎn)終末細(xì)胞和經(jīng)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后的細(xì)胞產(chǎn)品等。檢測樣本量應(yīng)至少確保95%以上的可能性檢出一個臨床劑量中的1個復(fù)制型病毒。方法開發(fā)時應(yīng)明確復(fù)制型病毒的擴(kuò)增細(xì)胞和指示細(xì)胞的選擇依據(jù)，需關(guān)注各檢測方法對應(yīng)的樣本量、陰性對照、陽性對照、操作流程、檢測標(biāo)志物、檢測限、判定標(biāo)準(zhǔn)等。建議申請人根據(jù)所用病毒包裝系統(tǒng)設(shè)計特異的檢測標(biāo)志物，同時鼓勵申請人采取2種以上基于不同原理針對不同標(biāo)志物的檢測方法，從而提高復(fù)制型病毒的檢出率。另外，申請人應(yīng)考慮待檢樣本對指示細(xì)胞生長的抑制作用等，研究、設(shè)置合理的待測樣本病毒滴度范圍，并在每批樣品檢測時設(shè)置抑制組對照。

可復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒（RCR）檢測：建議采用敏感的指示細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行RCR 檢測。RCR擴(kuò)增細(xì)胞與待測樣本進(jìn)行共培養(yǎng)以最大程度擴(kuò)增RCR，在一定傳代次數(shù)和時間的傳代培養(yǎng)后取適量上清接種RCR指示細(xì)胞培養(yǎng)，以觀察、計數(shù)細(xì)胞病變集落或者進(jìn)行RCR標(biāo)志物的檢測。

可復(fù)制型慢病毒（RCL）檢測：對于HIV衍生的慢病毒載體，其RCL檢測所用陽性對照可考慮使用缺乏輔助基因的 HIV 弱毒株、以 VSV-G 作為包膜蛋白的 HIV毒株等，應(yīng)明確陽性對照毒株的結(jié)構(gòu)和制備方法，并在符合要求的生產(chǎn)環(huán)境中妥善操作和使用。RCL檢測指標(biāo)方面，通常認(rèn)為p24蛋白、逆轉(zhuǎn)錄酶序列、psigag和VSV-G序列等的檢出可反映RCL的存在。

復(fù)制型腺病毒（RCA）檢測：對于大多數(shù)基于腺病毒的產(chǎn)品，建議申請人檢測每個生產(chǎn)批次載體的RCA。建議質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)擬定為3×10¹⁰個病毒顆粒中最大RCA 含量為1。

復(fù)制型AAV（rcAAV）檢測：rcAAV可能會在輔助病毒存在的情況下復(fù)制。檢測時可以在輔助病毒存在的情況下擴(kuò)增AAV，隨后采用PCR測定Rep/反向末端重復(fù)序列（ITR）、連接序列，以及Rep和Cap序列等，進(jìn)行rcAAV的檢測。

生物學(xué)活性：為在整個產(chǎn)品開發(fā)過程中研究病毒載體的活性、質(zhì)量、穩(wěn)定性等方面的變化，應(yīng)在臨床前和探索性臨床研究期間開發(fā)生物學(xué)活性檢測方法。應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品具體情況，建立至少1個反映產(chǎn)品的生理和/或藥理作用模式的生物學(xué)活性指標(biāo)。鼓勵檢測兩種生物學(xué)活性：將目的基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞的能力；以及表達(dá)的轉(zhuǎn)基因的生物學(xué)效應(yīng)。上市階段，應(yīng)根據(jù)載體的作用機(jī)制，盡可能確定與療效（替代、補(bǔ)償、阻斷、修正特定基因作用等）最相關(guān)的質(zhì)量屬性，完善檢測方法，建立合適的標(biāo)準(zhǔn)品，明確生物學(xué)活性計算方式等。

微生物污染物：應(yīng)參考《中國藥典》等相關(guān)指南，檢測所有可能引入病毒載體的污染物，包括細(xì)菌、真菌、支原體、細(xì)菌內(nèi)毒素等。需按照ICH指導(dǎo)原則Q5A 的規(guī)定對種子和細(xì)胞庫、中間體和最終產(chǎn)品進(jìn)行嚴(yán)格的外源性病毒檢測。必要時，可通過病毒清除研究確定生產(chǎn)工藝相關(guān)步驟的病毒減少倍數(shù)。

理化檢測：常規(guī)的理化檢測項目包括裝量、可見異物、不溶性微粒、滲透壓、 pH、輔料含量等。應(yīng)采用經(jīng)驗證的方法開展檢測，并根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)、批分析數(shù)據(jù)等設(shè)置合理的標(biāo)準(zhǔn)限度。

4.2 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方面，應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品質(zhì)量設(shè)計、工藝開發(fā)、驗證研究，以及多批放行檢測和穩(wěn)定性結(jié)果，結(jié)合早期非注冊臨床研究批次、非臨床研究批次，以及國內(nèi)外同類產(chǎn)品質(zhì)量，結(jié)合合理的統(tǒng)計學(xué)方法擬定各檢測指標(biāo)的可接受標(biāo)準(zhǔn)。需明確載體原液、半成品（如有）、制劑的可接受標(biāo)準(zhǔn)，包括參數(shù)、方法、標(biāo)準(zhǔn)限度等。病毒載體的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)通常應(yīng)包括鑒別、純度、含量、生物學(xué)活性、無菌性、內(nèi)毒素水平和支原體等。應(yīng)規(guī)范開展病毒標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)定，確定標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性特征和相關(guān)貯存條件。

方法學(xué)研究與驗證方面，應(yīng)描述評估產(chǎn)品質(zhì)量的所有分析方法，制定詳細(xì)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，并指定使用的標(biāo)準(zhǔn)品、設(shè)備等。應(yīng)按照《中國藥典》、ICH相關(guān)指導(dǎo)原則等全面驗證批放行所用的分析方法，關(guān)注檢測方法的靈敏度、重復(fù)性、耐用性等。在啟動臨床試驗之前，用于測定劑量的試驗如qPCR測定載體基因組滴度、轉(zhuǎn)化單位、噬菌斑形成單位、轉(zhuǎn)化細(xì)胞效率等方法必須經(jīng)過驗證；用于檢測復(fù)制型病毒的分析方法應(yīng)至少完成適用性、靈敏度、檢測限等方面的初步方法學(xué)驗證，以確保載體產(chǎn)品的安全性。臨床試驗階段如進(jìn)行了方法學(xué)優(yōu)化或方法變更，應(yīng)對新舊方法的差異進(jìn)行研究和論證，做好方法學(xué)橋接研究。

（二）核酸類基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)

隨著生命科學(xué)研究的深入發(fā)展，新興的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)不斷涌現(xiàn)，包括核酸類基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)和特異性基因編輯工具等。常見的核酸類基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)包括DNA質(zhì)粒、iBAC，S/MAR等基于染色體的載體、轉(zhuǎn)座子載體、TALEN 系統(tǒng)、CRISPR-Cas系統(tǒng)、episomal系統(tǒng)、mRNA等。為提高基因轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞的效率，促進(jìn)載體有效的跨越細(xì)胞膜、內(nèi)涵體-溶酶體系統(tǒng)和核膜，常使用基因遞送材料輔助核酸載體進(jìn)行目標(biāo)細(xì)胞的基因修飾，包括脂質(zhì)體復(fù)合物、陽離子多聚物、陽離子多肽、環(huán)糊精及衍生物、殼聚糖及衍生物和其他無機(jī)材料等。

核酸載體的臨床使用風(fēng)險主要包括復(fù)合基因遞送體系的自身毒性、基因編輯時基因脫靶導(dǎo)致的毒性、載體自身的免疫原性等。對于整合型載體還應(yīng)考慮插入突變的風(fēng)險，應(yīng)對插入位點(diǎn)進(jìn)行分析并說明對細(xì)胞存在的潛在的安全性影響，并對分析方法的合理性進(jìn)行說明。使用核酸載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)或修飾時，應(yīng)持續(xù)關(guān)注細(xì)胞產(chǎn)品中載體系統(tǒng)的殘留情況，分析外源DNA在基因組中的插入位置、拷貝數(shù)等，監(jiān)控基因編輯用酶的細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)時間等，并在受試者給藥后進(jìn)行長期安全性監(jiān)測。

對含有序列特異性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的基因編輯工具，應(yīng)考察脫靶效應(yīng)以及脫靶效應(yīng)可能帶來的潛在安全性影響。非特異性基因打靶主要有三個來源：（1）基因編輯工具的特異性有限引起的基因組結(jié)構(gòu)性、小范圍的突變，或者點(diǎn)突變；（2）多靶點(diǎn)基因編輯時，靶位點(diǎn)之間會出現(xiàn)基因組重排現(xiàn)象，帶來基因組結(jié)構(gòu)突變；（3）編碼基因編輯工具的DNA載體非特異性插入基因組位點(diǎn)，殘留DNA元件隨機(jī)存在于基因組?；诖?，應(yīng)該從以下幾方面考慮脫靶效應(yīng)及相應(yīng)的安全性影響：（1）基因組結(jié)構(gòu)突變的檢測和分析：利用單個細(xì)胞核型分析和預(yù)測可能出現(xiàn)基因組重排的區(qū)域進(jìn)行深度測序分析，來監(jiān)控基因轉(zhuǎn)導(dǎo)造成的基因組結(jié)構(gòu)突變和突變占比。（2）單點(diǎn)和小規(guī)?；蛲蛔兊臋z測和分析：基于生物信息學(xué)預(yù)測潛在脫靶位點(diǎn)，或基于細(xì)胞的體外試驗方法對模式細(xì)胞及基因轉(zhuǎn)導(dǎo)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行潛在脫靶位點(diǎn)的研究。對于鑒定到的基因組結(jié)構(gòu)突變位點(diǎn)和基因組單堿基和小范圍突變位點(diǎn)，按照風(fēng)險程度，需要結(jié)合體外試驗（軟瓊脂成瘤試驗，或非細(xì)胞因子介導(dǎo)的生長實(shí)驗等）或/和體內(nèi)實(shí)驗（如免疫缺陷小鼠成瘤試驗）來進(jìn)一步評估脫靶位點(diǎn)產(chǎn)生的突變對相關(guān)基因以及相應(yīng)安全性影響，并進(jìn)行風(fēng)險-收益評估。（3）如果基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)為非整合系統(tǒng)，需對最終產(chǎn)品中編碼基因轉(zhuǎn)導(dǎo)修飾系統(tǒng)的DNA載體殘存進(jìn)行檢測，分析和風(fēng)險評估。

1、分子設(shè)計和上游構(gòu)建

應(yīng)明確載體基因遞送的原理和過程，結(jié)合臨床使用安全性合理設(shè)計轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。根據(jù)不同載體類型及作用機(jī)制，應(yīng)闡明靶基因選擇的依據(jù)、靶位點(diǎn)選擇的依據(jù)以及基因修飾后對靶位點(diǎn)和靶基因的預(yù)期影響。應(yīng)提供完整的靶位點(diǎn)序列并列出基因組內(nèi)所有的完全匹配的靶位點(diǎn)的位置信息，并注明所使用的參考基因組版本信息。在開發(fā)過程中應(yīng)同時關(guān)注基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、脫靶效率、插入突變情況、目的基因在靶細(xì)胞中整合位點(diǎn)及表達(dá)的拷貝數(shù)等。建議針對載體的不同類型和靶細(xì)胞的特點(diǎn)，對靶向序列、目的基因序列和基因編輯用酶等的序列進(jìn)行優(yōu)化，篩選最佳的靶向序列（如gRNA序列），盡可能提高基因編輯效率、目的基因整合效率等，并采取措施降低基因脫靶、插入突變的概率及對靶細(xì)胞基因組穩(wěn)定性的不良影響。

例如，CRISPR-Cas9 基因編輯系統(tǒng)臨床應(yīng)用的風(fēng)險包括目的基因脫靶整合、雙鏈DNA損傷、在靶細(xì)胞原癌基因和抑癌基因中的插入突變、優(yōu)勢克隆的出現(xiàn)如 p53 突變細(xì)胞等。為提高該系統(tǒng)的安全性，應(yīng)盡量降低 gRNA 與非目標(biāo)序列的同源性、合理優(yōu)化Cas9剪切酶的結(jié)構(gòu)等。轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)臨床應(yīng)用的風(fēng)險包括:質(zhì)粒骨架 DNA 和轉(zhuǎn)座酶基因在靶細(xì)胞基因組的插入、抑癌/癌基因中的插入、轉(zhuǎn)座子在基因組中移動、靶基因組的不穩(wěn)定性等。安全性相關(guān)的設(shè)計考慮主要包括為增強(qiáng)基因整合位點(diǎn)特異性進(jìn)行的轉(zhuǎn)座酶、轉(zhuǎn)座子序列的優(yōu)化，防控轉(zhuǎn)座子序列在基因組中移動從而優(yōu)化轉(zhuǎn)座酶/轉(zhuǎn)座子DNA的比例、質(zhì)粒個數(shù)以及轉(zhuǎn)座酶在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)時間等。

根據(jù)不同載體類型及作用機(jī)制，闡明載體所附帶的基因序列的設(shè)計考慮，包括染色體同源序列、啟動子、終止子、增強(qiáng)或減弱轉(zhuǎn)錄及翻譯效率的元件的選擇使用，以及密碼子優(yōu)化方法等。應(yīng)對可能使用到的病毒性啟動子、哺乳動物細(xì)胞或病毒終止子的安全性進(jìn)行研究分析。若使用非常用性或特殊的控制元件，應(yīng)分析其安全性和對基因產(chǎn)物表達(dá)的影響以及使用該元件的風(fēng)險-獲益比等。建議關(guān)注載體中質(zhì)粒骨架、轉(zhuǎn)基因、篩選標(biāo)記及其他任何調(diào)節(jié)元件序列的來源、序列優(yōu)化過程及安全性設(shè)計考慮，盡可能刪除非必要的元件，提供完整的載體核苷酸序列。建議避免使用抗青霉素或其它β-內(nèi)酰胺類抗生素抗性標(biāo)記基因，若需要抗性標(biāo)記，可使用臨床不良反應(yīng)發(fā)生率較低的抗生素對應(yīng)的抗性標(biāo)記。應(yīng)對治療序列和調(diào)節(jié)/控制序列等具體特征進(jìn)行測序確認(rèn)，確保載體序列的準(zhǔn)確性。

2、生產(chǎn)用原材料

應(yīng)在符合藥品GMP的條件下建立菌種庫。菌種庫建立和檢定及其他原材料方面，可參考病毒載體類基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)相關(guān)要求。對于采用重組技術(shù)或生物 /化學(xué)合成技術(shù)制備的生產(chǎn)用原材料，應(yīng)明確生產(chǎn)工藝和質(zhì)量控制情況。核苷酸等原材料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)含有可充分表征產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)的純度檢測指標(biāo)，包括質(zhì)譜、核磁、高效液相色譜等方法。

核酸基因遞送系統(tǒng)可能使用復(fù)合材料，應(yīng)對遞送系統(tǒng)制備涉及的關(guān)鍵原材料（脂質(zhì)、陽離子聚合物等）進(jìn)行充分的篩選和質(zhì)控。提供各組分的選擇依據(jù)、作用原理、來源、生產(chǎn)用原材料、生產(chǎn)工藝、特性鑒定、質(zhì)量控制和穩(wěn)定性的研究資料等，擬定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)含有可充分表征產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)的純度檢測方法。另外，應(yīng)對遞送材料的安全性進(jìn)行詳細(xì)的研究。對于明確使用已商品化的遞送材料，需提供國內(nèi)外使用該類物質(zhì)的情況及已完成的毒理、安全性研究和人體使用安全性研究數(shù)據(jù)。

3、生產(chǎn)工藝

應(yīng)在符合藥品GMP要求的條件下生產(chǎn)核酸載體。應(yīng)明確載體的生產(chǎn)規(guī)模、批次定義，明確生產(chǎn)工藝流程，關(guān)注相應(yīng)工藝步驟的目的、工藝流程步驟、過程控制策略、物料流轉(zhuǎn)及中間產(chǎn)物等。

DNA類非病毒載體（轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)、TALEN系統(tǒng)、CRISPR-Cas系統(tǒng)等）的生產(chǎn)工藝主要涉及質(zhì)粒DNA的生產(chǎn)。質(zhì)粒生產(chǎn)過程應(yīng)避免使用β-內(nèi)酰胺類抗生素，如需使用，應(yīng)對抗生素的殘留量進(jìn)行控制和安全性評估。生產(chǎn)過程建議避免使用 CsCl、溴化乙錠、氯仿等毒性物質(zhì)，避免使用胰蛋白胨、動物源RNA酶等可能引入外源因子的原材料等。  

大規(guī)模制備質(zhì)粒DNA的一般步驟包括質(zhì)粒發(fā)酵、菌體收集、菌體裂解、質(zhì)粒純化、濃縮、灌裝等。應(yīng)對關(guān)鍵工藝參數(shù)進(jìn)行探索和優(yōu)化，建立穩(wěn)定的質(zhì)粒規(guī)?；a(chǎn)工藝。關(guān)鍵工藝參數(shù)可能包括發(fā)酵培養(yǎng)基組成、發(fā)酵培養(yǎng)溫度、堿裂解緩沖液及中和緩沖液的組成、堿裂解時間、層析柱載量、層析流速等。應(yīng)關(guān)注生產(chǎn)全過程對質(zhì)粒結(jié)構(gòu)和功能可能的影響，如堿裂解步驟可能產(chǎn)生的質(zhì)粒不可逆變性的情況。純化工藝開發(fā)過程中，應(yīng)根據(jù)質(zhì)粒的實(shí)際大小選擇合適的柱層析填料，最大程度去除宿主 RNA、宿主 DNA、DNA 碎片和細(xì)菌內(nèi)毒素等雜質(zhì)。應(yīng)設(shè)置合理的過程控制指標(biāo)和可接受標(biāo)準(zhǔn)，如質(zhì)粒中間體的濃度、超螺旋比例、雜質(zhì)殘留量等。

RNA類載體（siRNA、mRNA等）的生產(chǎn)一般包括體外化學(xué)合成和DNA轉(zhuǎn)錄兩種生產(chǎn)工藝。mRNA 的制備工藝步驟常含有采用轉(zhuǎn)錄模板進(jìn)行 mRNA 體外轉(zhuǎn)錄、 mRNA加帽、去磷酸化、DNA酶處理、mRNA純化等步驟。應(yīng)對關(guān)鍵工藝參數(shù)及控制范圍進(jìn)行確認(rèn)，如NTP濃度、轉(zhuǎn)錄時間、反應(yīng)溫度、加帽反應(yīng)物料投料比、層析介質(zhì)、動態(tài)載量等，關(guān)注mRNA回收率、雜質(zhì)去除率、加帽率、mRNA片段的完整性以及序列的準(zhǔn)確性等方面。生產(chǎn)過程中應(yīng)設(shè)置合理的過程控制指標(biāo)，如 mRNA 濃度、雙鏈mRNA含量、不完整mRNA含量、殘留DNA、無菌、內(nèi)毒素等。

載體系統(tǒng)如含有重組蛋白質(zhì)組分的，可參考重組DNA制品生產(chǎn)的相關(guān)要求。

制劑工藝方面，應(yīng)明確制劑處方、輔料來源和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等。對于復(fù)合核酸載體，應(yīng)明確制劑處方中每種組分的作用、含量及選擇依據(jù)，建議根據(jù)核酸-遞送系統(tǒng)的相互作用、核酸的轉(zhuǎn)染效率、動物藥效學(xué)研究、毒理研究、生產(chǎn)工藝可控性、載體穩(wěn)定性等方面的研究篩選和確定合適的遞送系統(tǒng)和制劑處方。應(yīng)研究制劑生產(chǎn)工藝對載體質(zhì)量屬性的影響，如復(fù)合率、包封率、粒徑及分布、電位等。應(yīng)確定關(guān)鍵工藝參數(shù)的可接受范圍，包括核酸濃度、各復(fù)合材料的濃度、緩沖體系、pH、混合流速、壓力、純化工藝參數(shù)等。制劑生產(chǎn)過程可能包括后續(xù)純化步驟，以去除未包封的核酸、游離的脂質(zhì)材料或包封過程中引入的雜質(zhì)等。如果凍干，應(yīng)開展凍干工藝對載體質(zhì)量、顆粒相關(guān)特性、生物學(xué)活性等方面的研究，擬定適宜的工藝參數(shù)范圍。過程控制方面，應(yīng)在適宜的階段建立合適的控制指標(biāo)及可接受標(biāo)準(zhǔn)，如核酸含量、包封率、粒度大小及分布、溶劑殘留等。  

涉及使用電脈沖裝置進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)核酸遞送的，應(yīng)對核酸濃度、細(xì)胞密度、電脈沖程序（脈沖個數(shù)、時間間隔、電壓、電流等）相關(guān)參數(shù)進(jìn)行研究和確認(rèn)。

需開展完整的載體工藝驗證研究，包括工藝過程控制確認(rèn)、中間體存儲穩(wěn)定性研究、多批次質(zhì)量分析以及雜質(zhì)清除研究等。應(yīng)在早期臨床試驗階段完成安全性相關(guān)驗證研究，如無菌灌裝、清潔驗證等。申報上市階段，應(yīng)在商業(yè)化規(guī)模條件下連續(xù)生產(chǎn)多個批次開展工藝驗證研究，證明生產(chǎn)工藝的穩(wěn)健性。

4、質(zhì)量研究與質(zhì)量控制

4.1 質(zhì)量研究

核酸類載體的質(zhì)量特性研究通常包括理化特性、結(jié)構(gòu)特征、純度、雜質(zhì)分析、生物學(xué)活性等。應(yīng)采用多個代表性批次開展載體和遞送系統(tǒng)的質(zhì)量研究。載體系統(tǒng)如含有RNA組分以及重組蛋白組分的，可參考相關(guān)指導(dǎo)原則等開展質(zhì)量研究。

結(jié)構(gòu)和理化特性：應(yīng)對核酸序列的完整性、準(zhǔn)確性進(jìn)行分析，進(jìn)行酶切鑒定及全序列測定等研究。對于DNA序列，可采用限制性內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切，對酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，觀察是否有特征性的帶型；可以用PCR方法對插入片段進(jìn)行擴(kuò)增，分析插入的基因片段的大小是否與預(yù)計的大小一致。對于RNA序列，可采用逆轉(zhuǎn)錄測序的方法進(jìn)行序列確認(rèn)。應(yīng)關(guān)注核酸序列的降解情況，采用瓊脂糖凝膠電泳、高效液相色譜、毛細(xì)管電泳等方法開展純度的研究。建議開展核酸濃度、修飾比例、物理特性（如外觀、pH）的研究。如可能，建議評估核酸本身的免疫原性。

對于復(fù)合核酸載體，應(yīng)考察載體的特性、復(fù)合組分和所得復(fù)合核酸序列。包括復(fù)合物的結(jié)構(gòu)以及載體與帶負(fù)電荷的RNA或DNA之間的相互作用。復(fù)合/遞送系統(tǒng)的性質(zhì)應(yīng)充分表征，內(nèi)容應(yīng)包括形態(tài)、粒度分布、表面電荷以及包封率等。

生物學(xué)活性：通常包括對基因轉(zhuǎn)移和編輯效率（轉(zhuǎn)導(dǎo)效率/遞送效率）、治療序列表達(dá)的水平、表達(dá)產(chǎn)物的功能或制品的生理功能的測定。應(yīng)首選定量檢測方法，如可通過轉(zhuǎn)基因或基因編輯產(chǎn)物的表達(dá)量和功能進(jìn)行分析。可以用載體體外轉(zhuǎn)染檢測細(xì)胞，檢測其蛋白水平表達(dá)量變化，其表達(dá)目的蛋白的大小應(yīng)與預(yù)計大小相同。體外方法不可行時，還可以采用動物離體組織或動物體內(nèi)檢測方法進(jìn)行檢測，檢測轉(zhuǎn)基因及基因編輯產(chǎn)物表達(dá)或敲低的生理功能等。檢測時需要采用相應(yīng)的活性標(biāo)準(zhǔn)品作為對照。

雜質(zhì)：應(yīng)對生產(chǎn)工藝、貯存、用于保存載體的密封容器中產(chǎn)生的、穩(wěn)定性研究批次中發(fā)現(xiàn)的潛在雜質(zhì)進(jìn)行充分研究，包括工藝相關(guān)雜質(zhì)和產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)。應(yīng)鑒別含缺失、重排、雜交或突變序列的載體等產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)，并對雜質(zhì)水平進(jìn)行定量。應(yīng)關(guān)注生產(chǎn)過程中影響載體關(guān)鍵質(zhì)量屬性的潛在降解，例如降低轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的質(zhì)粒形態(tài)或通過氧化或解聚等方式降解的核酸復(fù)合物等。對于復(fù)合核酸，應(yīng)說明在生產(chǎn)過程中形成復(fù)合物時產(chǎn)生的副產(chǎn)物。

工藝相關(guān)雜質(zhì)：核酸的純化工藝中可能引入乙醇、異丙醇等有機(jī)溶劑，這些物質(zhì)可能對人體有潛在的危害，應(yīng)在成品中限制其含量，應(yīng)建立檢測方法并制定殘留量的標(biāo)準(zhǔn)。對于復(fù)合核酸，工藝相關(guān)雜質(zhì)包括遞送材料相關(guān)雜質(zhì)，如材料合成產(chǎn)生的雜質(zhì)、不飽和脂質(zhì)氧化及相關(guān)降解產(chǎn)物、顆粒聚集產(chǎn)生的顆粒物、游離的復(fù)合材料等。

產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)：對于DNA類產(chǎn)品的相關(guān)雜質(zhì)，建議關(guān)注超螺旋比例、殘留宿主DNA、宿主蛋白殘留、殘留RNA等。超螺旋比例的研究主要是分析超螺旋結(jié)構(gòu)與線性和松弛性質(zhì)粒的比例?？刹捎铆傊悄z電泳的方法對制品進(jìn)行電泳分析，分析各帶型所占的比例；鼓勵采用先進(jìn)的定量分析技術(shù)（如高效液相色譜法）進(jìn)行超螺旋比例的分析。一般采用瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測制品中有無RNA，要求無明顯的 RNA 帶型；鼓勵采用先進(jìn)的技術(shù)進(jìn)行殘留 RNA 的檢測?？刹捎?Northern blot、qPCR的方法檢測制品中殘留的宿主DNA的含量，在該方法的研究時應(yīng)建立宿主DNA的標(biāo)準(zhǔn)品，并對該類試劑的敏感性和特異性進(jìn)行驗證。可以采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測制品中宿主蛋白的殘余量，在該方法的研究過程中應(yīng)建立宿主蛋白的定量標(biāo)準(zhǔn)。對于RNA類產(chǎn)品的相關(guān)雜質(zhì)，建議關(guān)注降解/斷裂產(chǎn)生的RNA片段、加帽不完全的mRNA、修飾過度的RNA、RNA錯配序列、RNA 氧化產(chǎn)物等。

4.2 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)  

應(yīng)進(jìn)行風(fēng)險控制分析并結(jié)合工藝驗證、臨床試驗及商業(yè)化批次質(zhì)量分析、穩(wěn)定性研究數(shù)據(jù)等制定完整的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，明確各檢測項對應(yīng)的分析方法、標(biāo)準(zhǔn)限度范圍及標(biāo)準(zhǔn)品等。對于一般工藝相關(guān)雜質(zhì)，如經(jīng)充分驗證證明工藝可對其有效、穩(wěn)定地清除，可結(jié)合工藝進(jìn)行控制，相關(guān)殘留檢測可不列于檢定項目中。

常見的DNA類非病毒載體的質(zhì)量控制項目包括外觀、pH、鑒別、含量/濃度檢測、均一性、序列測定、可見異物、雜質(zhì)、微生物安全性等，具體如下：

外觀檢查：根據(jù)樣品的特征建立外觀的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

pH值檢測：可參考《中國藥典》根據(jù)一般生物制品的要求建立標(biāo)準(zhǔn)。

DNA含量檢測：應(yīng)建立檢測含量的方法，如紫外吸光光度法。實(shí)測值應(yīng)與制品的標(biāo)示量相符。

鑒別：建議采用序列測定進(jìn)行鑒別，也可使用限制性酶切方法，結(jié)果應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)品一致。

純度：一般可以檢測樣品在波長為 260nm 和 280nm 的紫外吸收值，并計算A260/A280的比值，評價制品的總體純度。

質(zhì)粒大小的均一性和結(jié)構(gòu)的分析：建議采用靈敏度高的檢測方法對質(zhì)粒結(jié)構(gòu)和超螺旋的比例等進(jìn)行檢測。

生物學(xué)活性：根據(jù)載體的作用原理，應(yīng)至少建立一種方法進(jìn)行生物學(xué)活性檢測，建立適宜的可接受標(biāo)準(zhǔn)。  

無菌實(shí)驗：應(yīng)按照《中國藥典》建立適宜的方法開展檢測，確保制品中應(yīng)無微生物的污染。

細(xì)菌內(nèi)毒素：應(yīng)按照《中國藥典》建立適宜的方法開展檢測。

抗生素殘余量的檢測：應(yīng)建立檢測抗菌素的檢測方法并制定抗生素殘留量的要求。

雜質(zhì)殘留：純化工藝中可能用的乙醇、磁珠等，如可能對人體有潛在的危害，應(yīng)建立檢測方法在載體成品中限制其含量，并從臨床使用安全性和有效性的角度說明雜質(zhì)限度制定的依據(jù)。應(yīng)檢測載體成品中宿主DNA、宿主RNA和宿主蛋白的殘留量等，并建立適宜的可接受標(biāo)準(zhǔn)。

常見的核酸-復(fù)合類載體的質(zhì)量控制項目包括外觀、pH、顆粒大小及分散系數(shù)（PDI）、濁度、折光率、Zeta電位、滲透壓、鑒別、序列測定、含量/濃度檢測、生物學(xué)活性、序列完整性、包封率、遞送系統(tǒng)各組分含量、游離材料、可見異物、雜質(zhì)、微生物安全性等。

方法學(xué)研究與驗證方面，應(yīng)描述評估產(chǎn)品質(zhì)量的所有分析方法，制定詳細(xì)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，并指定使用的標(biāo)準(zhǔn)品、設(shè)備等。申報臨床時應(yīng)能初步驗證方法的適用性，對重要指標(biāo)或關(guān)鍵質(zhì)量屬性，應(yīng)提供與研發(fā)階段控制要求相符的驗證研究數(shù)據(jù)。例如對于雜質(zhì)含量、細(xì)菌內(nèi)毒素等影響產(chǎn)品安全性的檢測項目，申報臨床時應(yīng)至少完成適用性、靈敏度、檢測限等方面的初步方法學(xué)驗證。申報上市階段應(yīng)按照《中國藥典》、ICH相關(guān)指導(dǎo)原則等全面驗證批放行所用的分析方法，關(guān)注檢測方法的靈敏度、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、耐用性等。

六、穩(wěn)定性研究  

申請人應(yīng)針對代表性批次載體的原液、制劑和生產(chǎn)過程中儲存的中間體開展穩(wěn)定性研究，一般包括長期穩(wěn)定性、加速穩(wěn)定性、影響因素、強(qiáng)制降解、運(yùn)輸穩(wěn)定性研究等。建議在適當(dāng)?shù)臏囟认乱约霸谂c預(yù)期保存時間相符的時間點(diǎn)開展試驗。穩(wěn)定性考察條件應(yīng)考慮溫度、光照的變化或反復(fù)凍融（冷凍儲存時）、振搖等方面。通常載體在冷凍或冷藏條件下保存，應(yīng)開展載體產(chǎn)品使用中穩(wěn)定性（復(fù)溶后或解凍）研究，評估載體與復(fù)溶稀釋劑的相容性等。

應(yīng)明確各穩(wěn)定性研究所用樣品、包裝容器、保存容器、檢測時間點(diǎn)、試驗溫度和分析檢項等。穩(wěn)定性研究樣品應(yīng)采用與商業(yè)化載體產(chǎn)品相同材質(zhì)的包裝容器包裝。建議采用能夠反映載體安全性、有效性、質(zhì)量可控性的敏感指標(biāo)開展穩(wěn)定性研究。若穩(wěn)定性數(shù)據(jù)提示輔料在有效期內(nèi)氧化、降解等對產(chǎn)品質(zhì)量有不良影響，有必要在穩(wěn)定性試驗中對輔料含量加以監(jiān)測。建議至少在擬定有效期的初期和末期進(jìn)行無菌試驗或替代試驗（如容器/密封系統(tǒng)的完整性試驗）。穩(wěn)定性方案應(yīng)足以證明在擬定的儲存和運(yùn)輸條件下可維持產(chǎn)品完整性、純度、可回收的樣本體積、產(chǎn)品聚集特征和效價。

對于病毒載體類基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)，建議重點(diǎn)考察病毒載體的滴度、降解產(chǎn)物及載體完整性、純度、雜質(zhì)、微生物安全性指標(biāo)、生物學(xué)活性等關(guān)鍵質(zhì)量屬性。對于非病毒載體類基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)，建議重點(diǎn)關(guān)注載體的理化特性、序列及結(jié)構(gòu)完整性、包封率、雜質(zhì)等關(guān)鍵質(zhì)量屬性。基于DNA或/和RNA的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)的產(chǎn)品的穩(wěn)定性研究建議包括核酸分子量的穩(wěn)定性。由于DNA超螺旋結(jié)構(gòu)的比例可能影響DNA的轉(zhuǎn)染率，該類制品的穩(wěn)定性研究應(yīng)重點(diǎn)考察超螺旋結(jié)構(gòu)的比例。針對基于RNA的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)（如siRNA、antisense RNA、 mRNA等）和針對基于含有蛋白質(zhì)活性成分的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)（如ZFN蛋白， TALEN蛋白，Cas9蛋白與guide RNA復(fù)合物等）應(yīng)額外關(guān)注產(chǎn)品組分在常溫下的穩(wěn)定性以及在最終使用條件下（如從干粉溶解為注射劑）的穩(wěn)定性。涉及使用脂質(zhì)等遞送系統(tǒng)的產(chǎn)品，應(yīng)關(guān)注脂質(zhì)輔料的降解等。如已評估部分研究項目對載體儲存和運(yùn)輸?shù)葪l件不敏感，可提供充分的支持性數(shù)據(jù)，合理簡化檢測指標(biāo)。

建議基于放行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、穩(wěn)定性指示特性和降解產(chǎn)物的限度合理設(shè)定載體產(chǎn)品貨架期質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

七、內(nèi)包材研究

應(yīng)說明載體原液、制劑和中間品的初級、次級包裝容器，明確包材的選擇依據(jù)，對包裝容器的來源、質(zhì)量要求、相容性進(jìn)行說明。對生產(chǎn)工藝中所有與載體產(chǎn)品接觸的容器和一次性使用材料（如儲存袋、過濾膜、層析介質(zhì)、管路等），應(yīng)開展相容性研究。對于載體成品，應(yīng)根據(jù)制劑組分和保存條件等，完整開展載體成品與直接接觸的包裝容器間的相容性研究，包括可提取物和浸出物分析等。

八、工藝變更

工藝開發(fā)階段,常見的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)的工藝變更包括生產(chǎn)場地變更、規(guī)模放大、細(xì)胞庫變更、生產(chǎn)用原材料變更、純化工藝優(yōu)化等。應(yīng)研究工藝變更具體事項對基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)和所修飾細(xì)胞安全性、特性、純度、生物學(xué)活性等方面的影響，并對工藝變更前后的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)的穩(wěn)定性進(jìn)行研究。建議綜合變更事項、分析檢測能力以及臨床開發(fā)所處階段等因素綜合設(shè)計可比性研究方案，設(shè)置合理的可比性研究檢測指標(biāo)及可接受標(biāo)準(zhǔn)。質(zhì)量對比研究中建議納入多個代表性批次進(jìn)行研究，關(guān)注檢測項目的全面性、預(yù)設(shè)對比研究標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置的合理性、檢測方法的有效性和檢測結(jié)果分析的客觀性等。如條件許可，應(yīng)對各研發(fā)階段的載體進(jìn)行留樣，留樣的數(shù)量和保存條件應(yīng)能滿足后續(xù)工藝、質(zhì)量對比研究的需要。

九、環(huán)境和生物安全性

基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)生產(chǎn)和使用過程應(yīng)遵守藥品的相關(guān)基本要求，包括對其生產(chǎn)和使用環(huán)境的要求，以及其生產(chǎn)和使用過程對環(huán)境的潛在風(fēng)險的防控等。應(yīng)識別載體對環(huán)境的潛在風(fēng)險，根據(jù)載體釋放到環(huán)境中的組分和受暴露的生物體等評估對環(huán)境影響的程度，通過環(huán)境風(fēng)險評估進(jìn)行研究并采取對應(yīng)措施和替代方案。

對于在人體及環(huán)境中具有生長繁殖能力的病毒載體類基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)，需要結(jié)合病毒株的宿主范圍、傳播途徑、致病性、遺傳穩(wěn)定性等，進(jìn)行產(chǎn)品生物安全及環(huán)境影響相關(guān)評價，對其在生產(chǎn)（如廢液處理）、臨床使用、存儲、處置等過程中對密切接觸人群及環(huán)境的影響，進(jìn)行風(fēng)險評估并提供防控措施?？赡艿拇胧┌ㄔ谶m當(dāng)生物防護(hù)條件下處理載體及相關(guān)制品；減少氣霧形成的控制措施等。

十、名詞解釋

載體（Vector）：運(yùn)載遺傳物質(zhì)的工具，包括病毒類載體和非病毒類載體等。

原材料（Raw materials）：指生產(chǎn)過程中使用的所有生物材料和化學(xué)材料，不包括輔料。

十一、參考文獻(xiàn)

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