藥物免疫原性研究技術(shù)指導(dǎo)原則

二〇二一年三月

目錄

一、概述

二、免疫原性研究?jī)?nèi)容

三、抗藥抗體檢測(cè)

（一）試驗(yàn)設(shè)計(jì)考慮

（二）方法學(xué)開發(fā)與驗(yàn)證

（三）試驗(yàn)內(nèi)容

四、附錄

（一）免疫原性多層級(jí)檢測(cè)策略示意圖

（二）抗藥抗體檢測(cè)方法的開發(fā)與驗(yàn)證

（三）體外細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)

            一、概述

本指導(dǎo)原則中，藥物的免疫原性是指藥物和/或其代謝物誘發(fā)對(duì)自身或相關(guān)蛋白的免疫應(yīng)答或免疫相關(guān)事件的能力。免疫反應(yīng)的影響廣泛，從無臨床意義抗藥抗體的暫時(shí)出現(xiàn)，到嚴(yán)重危及生命。不必要或非預(yù)期的免疫反應(yīng)可能導(dǎo)致中和藥物的生物學(xué)活性，或與對(duì)應(yīng)的內(nèi)源性蛋白產(chǎn)生交叉免疫反應(yīng)，也可能導(dǎo)致過敏反應(yīng)和細(xì)胞因子釋放綜合征等不良事件的發(fā)生，對(duì)患者的安全和藥物的有效性均有重要影響。 

對(duì)于大多數(shù)藥物，不良免疫反應(yīng)一般由體液免疫機(jī)制介導(dǎo)的免疫應(yīng)答所致，因此抗藥抗體一直是定義該類藥物免疫原性的主要標(biāo)準(zhǔn)。但近年來隨著免疫調(diào)節(jié)類藥物在重大疾病中更加廣泛的應(yīng)用，細(xì)胞免疫機(jī)制介導(dǎo)的不良免疫反應(yīng)也應(yīng)得到重視。藥物的免疫原性受到多種因素的影響，患者自身和藥物相關(guān)因素均可能影響藥物的免疫原性。患者和疾病相關(guān)因素包括患者的免疫狀態(tài)和免疫能力、遺傳因素、預(yù)存抗體、給藥途徑、劑量和頻率等。藥物相關(guān)因素包括產(chǎn)品來源、結(jié)構(gòu)、聚合物的形成、糖基化、聚乙二醇化、雜質(zhì)、處方、包裝和儲(chǔ)存等。藥物開發(fā)的全生命周期中應(yīng)始終關(guān)注免疫原性研究，基于藥物作用機(jī)制，產(chǎn)品相關(guān)因素，以及擬用適應(yīng)證等因素預(yù)測(cè)免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，基于免疫原性風(fēng)險(xiǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)的研究進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別。在藥物的開發(fā)中，一方面應(yīng)盡量選擇免疫原性潛在風(fēng)險(xiǎn)較小的候選藥物，另一方面應(yīng)探索如何減少和控制免疫原性的不良影響。 

本指導(dǎo)原則適用于治療性蛋白質(zhì)、多肽及其衍生物，以及含有此類組分的藥物，例如抗體偶聯(lián)藥物。其他具有潛在免疫原性風(fēng)險(xiǎn)的藥物也可參考本指導(dǎo)原則。 

二、免疫原性研究?jī)?nèi)容

免疫原性研究主要聚焦在抗藥抗體的檢測(cè)和表征上，通常應(yīng)獲得抗藥抗體的發(fā)生率、滴度、存續(xù)時(shí)間和中和能力數(shù)據(jù)。有些情況下，需要對(duì)抗藥抗體進(jìn)一步表征，如同種型和亞型或者與相關(guān)內(nèi)源性蛋白的交叉反應(yīng)性。應(yīng)始終考察抗藥抗體生成與藥代/藥效動(dòng)力學(xué)、療效、以及安全性之間的相關(guān)性。免疫原性風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別中，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)也很重要，應(yīng)在適用的情況下考慮對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。如果觀察到臨床相關(guān)的免疫反應(yīng)，應(yīng)對(duì)其潛在機(jī)制進(jìn)行研究，并確定關(guān)鍵的影響因素。這些研究有助于控制和緩解策略的制定和實(shí)施，包括修改產(chǎn)品處方和篩查高風(fēng)險(xiǎn)患者人群。 

治療性蛋白藥物通常具有種屬差異，基于動(dòng)物免疫原性研究結(jié)果預(yù)測(cè)人體免疫原性具有局限性。但是，在非臨床研究中進(jìn)行免疫原性評(píng)價(jià)仍然具有一定意義。免疫原性相關(guān)反應(yīng)可導(dǎo)致非臨床研究結(jié)果復(fù)雜化并難以解釋，免疫原性數(shù)據(jù)有助于安全性數(shù)據(jù)的整體分析，因此免疫原性研究始終是治療性蛋白藥物非臨床安全性研究證據(jù)鏈的重要組成部分。應(yīng)考慮將新技術(shù)（新興的生物信息學(xué)、體外和體內(nèi)模型）用于開發(fā)過程中。對(duì)于細(xì)胞因子釋放綜合征、自身免疫反應(yīng)等免疫相關(guān)不良反應(yīng)，應(yīng)在藥物的開發(fā)早期進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。對(duì)于具有潛在風(fēng)險(xiǎn)的藥物, 除了在常規(guī)的動(dòng)物體內(nèi)毒性試驗(yàn)中進(jìn)行細(xì)胞因子相關(guān)檢測(cè)外，應(yīng)進(jìn)行體外細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)（具體試驗(yàn)方法見附錄三）。當(dāng)治療性蛋白藥物對(duì)應(yīng)的內(nèi)源蛋白具有不可替代的生理功能時(shí)，應(yīng)充分評(píng)估潛在自身免疫反應(yīng)介導(dǎo)的安全性風(fēng)險(xiǎn)。通?；趯?duì)內(nèi)源性蛋白生理功能的已有認(rèn)知，安全性風(fēng)險(xiǎn)是可以預(yù)估的，因此不必為了確定這些安全性風(fēng)險(xiǎn)而專門進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)。但是，如果缺乏足夠認(rèn)知，并且理論上提示存在安全性風(fēng)險(xiǎn)，則應(yīng)考慮對(duì)治療性蛋白藥物（或針對(duì)動(dòng)物的替代分子）進(jìn)行動(dòng)物免疫試驗(yàn)，以便于了解不良免疫反應(yīng)的潛在影響。 

生物類似藥開發(fā)時(shí)需要進(jìn)行免疫原性比較試驗(yàn), 生物類似藥和參照藥應(yīng)采用同樣的分析模式和采樣計(jì)劃。分析方法最好能同時(shí)檢測(cè)生物類似藥和參照藥的抗藥抗體，至少應(yīng)盡可能檢測(cè)到生物類似藥的所有抗藥抗體。無論采用單一分析方法還是兩套分析方法，均應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的交叉驗(yàn)證，以期獲得對(duì)生物類似藥和參照藥同樣的檢測(cè)性能。通常，應(yīng)對(duì)抗藥抗體生成和性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，并應(yīng)評(píng)估和解釋對(duì)臨床有效性和安全性指標(biāo)的潛在影響。 

當(dāng)生產(chǎn)工藝變更需要臨床試驗(yàn)支持時(shí)，免疫原性的研究應(yīng)與藥代動(dòng)力學(xué)、安全性和有效性試驗(yàn)相結(jié)合，應(yīng)優(yōu)先開展變更前后藥物的頭對(duì)頭試驗(yàn)。 

免疫原性研究涉及多學(xué)科及不同研發(fā)階段，免疫原性相關(guān)數(shù)據(jù)往往分散在上市申請(qǐng)的多個(gè)部分。建議對(duì)免疫原性研究結(jié)果進(jìn)行綜合概述，并將其放于 CTD2.7.2.4 特殊研究中，總結(jié)應(yīng)簡(jiǎn)明扼要，并包含詳細(xì)研究報(bào)告的鏈接。 

三、抗藥抗體檢測(cè)

制定與預(yù)期治療計(jì)劃相關(guān)的綜合分析策略對(duì)于闡明免疫原性數(shù)據(jù)的臨床相關(guān)性至關(guān)重要?？紤]到與臨床安全性和療效的相關(guān)性，免疫原性研究通常集中在對(duì)抗藥抗體的檢測(cè)和表征研究上。抗藥抗體檢測(cè)需要進(jìn)行謹(jǐn)慎且前瞻性的設(shè)計(jì)和計(jì)劃，包括分析方法的選擇和開發(fā)、合適的采樣點(diǎn)、充足的采樣體積、樣本采集的流程及儲(chǔ)存方法、以及數(shù)據(jù)分析選用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。 

（一）試驗(yàn)設(shè)計(jì)考慮

1.檢測(cè)策略 

抗藥抗體的檢測(cè)通常應(yīng)采用多層級(jí)分析方法，首先對(duì)所有樣本進(jìn)行篩選試驗(yàn)，之后對(duì)疑似抗體陽性樣本的特異性進(jìn)行確證試驗(yàn)，對(duì)已確證抗體陽性的樣本進(jìn)行滴度試驗(yàn)，以及對(duì)抗體中和活性進(jìn)行檢測(cè)。其中在已確證抗體陽性的樣本中，有時(shí)還應(yīng)考慮對(duì)抗體同種型、亞型和結(jié)合表位進(jìn)行檢測(cè)。免疫原性多層級(jí)檢測(cè)決策樹參見附錄一。 

在多層級(jí)的分析方法中，篩選試驗(yàn)又稱結(jié)合抗體試驗(yàn)，用于檢測(cè)與藥物結(jié)合的抗體；確證試驗(yàn)用于確定藥物結(jié)合抗體的特異性；滴度試驗(yàn)用于檢測(cè)抗藥抗體產(chǎn)生的強(qiáng)度；中和抗體是指能夠干擾藥物與其靶點(diǎn)相互作用的抗藥抗體，中和活性試驗(yàn)評(píng)估抗藥抗體對(duì)藥物的中和能力/程度。抗藥抗體滴度、持續(xù)周期、以及中和活性檢測(cè)信息對(duì)于判斷抗藥抗體對(duì)藥代動(dòng)力學(xué)、藥效動(dòng)力學(xué)、安全性和有效性的影響非常重要。在非臨床免疫原性研究中，通常根據(jù)非臨床藥效動(dòng)力學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)和安全性的研究結(jié)果，以及藥物的潛在免疫原性風(fēng)險(xiǎn)確定是否需要進(jìn)行除抗藥抗體發(fā)生率以外的研究。 

其他分析試驗(yàn)，如抗體同種型、亞型、抗原表位鑒定以及與內(nèi)源性靶點(diǎn)或其他產(chǎn)品的交叉反應(yīng)性的評(píng)價(jià)也具有重要作用。初步的篩選試驗(yàn)應(yīng)盡可能檢測(cè)到所有相關(guān)的免疫球蛋白（Ig）同種型抗體，但篩選試驗(yàn)無需進(jìn)一步確定同種型抗體。在某些情況下，應(yīng)建立可區(qū)分同種型抗體的分析方法。例如，對(duì)于過敏性反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)較高或觀察到過敏性反應(yīng)的藥物，則需要進(jìn)行抗原特異性的 IgE 檢測(cè)。對(duì)于粘膜途徑給藥，通常涉及到 IgA 抗體。有時(shí)需考慮對(duì)抗體亞型進(jìn)行檢測(cè)，例如，凝血因子Ⅷ所致的免疫反應(yīng)可能涉及到 IgG4 抗體。在有些情況下，可能需要進(jìn)行與其他蛋白交叉反應(yīng)的試驗(yàn)，如檢測(cè)抗藥抗體與相應(yīng)的內(nèi)源性蛋白的交叉反應(yīng)性。例如，當(dāng)治療性蛋白藥物在體內(nèi)具有一個(gè)高同源性的蛋白家族，為了解抗藥抗體是否影響蛋白家族中其它蛋白時(shí)，通常需要評(píng)估抗藥抗體的交叉反應(yīng)性。 

對(duì)于多結(jié)構(gòu)域治療性蛋白藥物，如聚乙二醇化蛋白、多特異性抗體，建議針對(duì)整個(gè)治療性蛋白藥物進(jìn)行初步篩選試驗(yàn)和確證試驗(yàn)，基于風(fēng)險(xiǎn)或產(chǎn)品特征，對(duì)確證為陽性的樣本進(jìn)一步開展域特異性評(píng)價(jià)。 

2.分析方法的選擇 

抗藥抗體檢測(cè)可以采用不同的方法和儀器，包含但不局限于：直接法、橋聯(lián)法和均相結(jié)合法。每種分析方法均有優(yōu)點(diǎn)和不足，包括檢測(cè)速度、靈敏度、選擇性、方法的響應(yīng)范圍、檢測(cè)不同免疫球蛋白的能力、檢測(cè)快速解離出的抗體的能力（如 IgM，在免疫反應(yīng)的早期出現(xiàn)），以及試劑的可獲得性。所有的分析方法都應(yīng)該考慮其檢測(cè)快速解離出的抗體的能力。如果無法檢測(cè)到此類免疫反應(yīng)早期出現(xiàn)的抗體，易造成真正陽性的抗體樣本未被檢出的情況。在分析中也要重點(diǎn)考慮表位的暴露情況，如果表位與固相載體或者其他報(bào)告試劑（如熒光染料、酶或生物素）結(jié)合，將導(dǎo)致抗原的構(gòu)象變化，這將掩蓋、暴露、改變或破壞與治療性蛋白藥物相關(guān)的抗體的結(jié)合位點(diǎn)，從而影響最后的檢測(cè)結(jié)果。 

3.試劑的選擇 

用于抗藥抗體檢測(cè)的有些試劑可以是標(biāo)準(zhǔn)化的或從商業(yè)來源獲得。然而，特定方法可能需要特定試劑，包括陽性對(duì)照抗體、陰性對(duì)照和系統(tǒng)適用性對(duì)照。應(yīng)根據(jù)檢測(cè)方法選擇合適的試劑，以最小化非特異性信號(hào)并維持足夠的靈敏度。陽性對(duì)照抗體和陰性對(duì)照的選擇見附錄二。 

（二）方法學(xué)開發(fā)與驗(yàn)證

方法學(xué)驗(yàn)證的程度主要取決于藥物的開發(fā)階段以及潛在的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于大多數(shù)藥物，在藥物開發(fā)的早期階段（如非臨床、臨床Ⅰ期和Ⅱ期研究階段），應(yīng)重點(diǎn)考察臨界值、靈敏度（包括藥物耐受性），選擇性和精密度，而弱化穩(wěn)健性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性的考察。對(duì)于高風(fēng)險(xiǎn)藥物，可能需要在臨床研究前進(jìn)行全面驗(yàn)證。對(duì)于關(guān)鍵性臨床試驗(yàn)和上市后研究，一般需要進(jìn)行全面的方法學(xué)驗(yàn)證。藥物開發(fā)全生命周期中，有可能根據(jù)研究需要進(jìn)行檢測(cè)方法參數(shù)的調(diào)整，在此情況下，應(yīng)合理追加相關(guān)的補(bǔ)充驗(yàn)證內(nèi)容；對(duì)于生物類似藥，免疫原性是可比性研究的一部分，在方法學(xué)驗(yàn)證中需要增加可比性驗(yàn)證內(nèi)容。此外，對(duì)于某些技術(shù)平臺(tái)，需增加對(duì)其他參數(shù)的驗(yàn)證，如采用表面等離子共振平臺(tái)時(shí)，需驗(yàn)證表面再生穩(wěn)定性、芯片基線標(biāo)準(zhǔn)、標(biāo)記試劑的效能及穩(wěn)定性等。具體的驗(yàn)證方法參見附錄二。 

（三）試驗(yàn)內(nèi)容

1.篩選試驗(yàn) 

篩選試驗(yàn)是抗藥抗體檢測(cè)的第一步，該分析方法需具有足夠的靈敏度以能檢測(cè)出樣本中低、高親和力的各種類型抗藥抗體。為確保真實(shí)樣本的檢出率，篩選試驗(yàn)應(yīng)具有一定的假陽性率（通常為 5%），但需規(guī)避出現(xiàn)假陰性。 

方法建立時(shí)應(yīng)盡可能選擇與待測(cè)樣本相同或相近的自然樣本群。應(yīng)根據(jù)需求對(duì)所選擇的方法進(jìn)行優(yōu)化。樣本（通常是血清或血漿）中可能含有影響檢測(cè)的成分，可導(dǎo)致產(chǎn)生假陽性或假陰性結(jié)果，和/或?qū)贵w含量產(chǎn)生錯(cuò)誤評(píng)估。例如補(bǔ)體成分或補(bǔ)體受體、甘露糖結(jié)合蛋白、Fc 受體、可溶性的靶分子及類風(fēng)濕因子。應(yīng)采用經(jīng)確證合理的方法以減少基質(zhì)效應(yīng)的潛在影響。 

此外，待測(cè)樣本中的殘留藥物可能與抗藥抗體結(jié)合，從而使檢測(cè)到的抗體含量降低。這種干擾帶來的影響取決于分析模式和抗體的特性?？赏ㄟ^多種經(jīng)驗(yàn)證的方法規(guī)避或解決，如酸解離、通過固相吸附除去過量的藥物、延長(zhǎng)孵育時(shí)間、以及稀釋樣本等方法。在某些情況下，可通過調(diào)整給藥間隔和采樣時(shí)間來降低殘留藥物的干擾。但該方法必須不能對(duì)抗體的檢測(cè)或患者的治療產(chǎn)生明顯影響。通常，應(yīng)證明分析方法的藥物耐受水平超過待測(cè)樣本中藥物的濃度（一般為藥物谷濃度）。 

2.確證試驗(yàn) 

確證試驗(yàn)是為了排除篩選試驗(yàn)中的假陽性樣本。篩選試驗(yàn)中檢測(cè)為陽性的樣本，需進(jìn)一步通過確證試驗(yàn)證明抗藥抗體的特異性。 

確證試驗(yàn)應(yīng)與篩選試驗(yàn)具有可比的靈敏度，但需要注意兩個(gè)試驗(yàn)的假陽性率不同，且確證試驗(yàn)應(yīng)有更高的特異性，并至少具有與篩選試驗(yàn)相當(dāng)?shù)倪x擇性，以識(shí)別假陽性樣本。通常，采用結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)抑制法進(jìn)行檢測(cè)，即在樣本中加入過量的藥物，隨后同時(shí)檢測(cè)加入藥物和未加入藥物樣本的信號(hào)值，若樣本中含有抗藥抗體，游離的藥物將競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗藥抗體，從而造成檢出的信號(hào)值下降。確證試驗(yàn)的方法和平臺(tái)可與篩選試驗(yàn)相同，也可不同。方法靈敏度需采用質(zhì)量單位，并使用系統(tǒng)適用性質(zhì)控進(jìn)行確認(rèn)，當(dāng)篩選試驗(yàn)和確證試驗(yàn)采用不同方法和平臺(tái)時(shí)，應(yīng)具有相似的靈敏度。 

若選擇競(jìng)爭(zhēng)性抑制方法，則建議使用未給予藥物的受試者樣本，加入抑制劑（通常是受試藥物）后，所產(chǎn)生信號(hào)的數(shù)據(jù)來確定臨界值。用于測(cè)定臨界值的藥物的競(jìng)爭(zhēng)濃度應(yīng)與將用于樣本檢測(cè)的濃度一致。這種方法可能不適用于在未給藥受試者中存在預(yù)存抗體的情況，此時(shí)建議從臨界值的評(píng)估中找出疑似陽性結(jié)果并予以剔除。當(dāng)沒有本底水平的陰性對(duì)照樣本時(shí)，應(yīng)采用滴度的改變或正交方法對(duì)篩選試驗(yàn)中呈陽性的樣本進(jìn)行確認(rèn)。對(duì)于確證為陽性的樣本，在某些情況下，需要對(duì)其特異性進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)考慮開發(fā)并驗(yàn)證針對(duì)樣本中雜質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的檢測(cè)方法，以區(qū)分抗體的結(jié)合是針對(duì)藥物相關(guān)成分還是工藝相關(guān)成分（如宿主細(xì)胞蛋白）。 

3.滴度試驗(yàn) 

滴度定義為樣本檢測(cè)值高于臨界值時(shí)的最大稀釋倍數(shù)。滴度檢測(cè)常與篩選試驗(yàn)使用相同的平臺(tái)。一般采用連續(xù)稀釋方法或通過量效曲線的線性部分外推來確定滴度。 

通常，滴度臨界值沿用篩選臨界值。在某些情況下，也應(yīng)考慮采用與篩選試驗(yàn)不同的臨界值。例如, 當(dāng)篩選臨界值落在陽性滴度曲線的低平臺(tái)區(qū)時(shí)，應(yīng)建立滴度試驗(yàn)臨界值。如無特殊情況, 通常采用 0.1%的假陽性率確定滴度臨界值。當(dāng)存在預(yù)存抗藥抗體時(shí)，則應(yīng)根據(jù)給藥后樣本中滴度的提升判斷經(jīng)治療后樣本中抗藥抗體的升高。 

4.中和活性試驗(yàn) 

中和活性是指抗藥抗體具有抑制藥物生物學(xué)活性的能力。中和抗體可以通過阻斷產(chǎn)品到達(dá)其靶標(biāo)或干擾受體/配體結(jié)合，從而干擾藥物的體內(nèi)活性。 

中和活性試驗(yàn)的分析模式選擇需要考慮多種因素，包括但不限于藥物本身的作用機(jī)制、檢測(cè)方法與體內(nèi)真實(shí)情況的相關(guān)性、方法本身的選擇性、生物基質(zhì)的干擾程度、靈敏度和穩(wěn)健程度等。檢測(cè)方法與藥物體內(nèi)作用機(jī)制的相關(guān)性為首要考慮因素。通常采用基于細(xì)胞的中和活性檢測(cè)方法。但是，當(dāng)藥物在體內(nèi)的作用機(jī)制與細(xì)胞關(guān)系較小，例如體液中游離靶點(diǎn)的拮抗反應(yīng)、酶反應(yīng)等，或者由于生物基質(zhì)干擾等因素，細(xì)胞學(xué)方法的變異程度、定量范圍、靈敏度等難以滿足方法學(xué)驗(yàn)證和樣本分析的需要時(shí)，可能需采用基于非細(xì)胞的試驗(yàn)方法（配體結(jié)合分析、酶反應(yīng)等）。在某些特殊情況下，結(jié)合高度靈敏的藥效動(dòng)力學(xué)和/或藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)可以判斷抗藥抗體對(duì)臨床藥效的影響，這些試驗(yàn)和指標(biāo)有可能代替中和抗體試驗(yàn)，這些數(shù)據(jù)的可替代性應(yīng)與監(jiān)管機(jī)構(gòu)進(jìn)行溝通交流。 

基于細(xì)胞的中和活性檢測(cè)方法通常在藥物活性測(cè)定方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行開發(fā)，這些方法的形式和測(cè)定終點(diǎn)因產(chǎn)品而異。中和活性檢測(cè)方法開發(fā)時(shí)，應(yīng)考察基質(zhì)效應(yīng)、藥物濃度、配體濃度等，并驗(yàn)證臨界值、精密度、選擇性、靈敏度等。中和活性分析方法一般不具有很好的藥物耐受性，因此應(yīng)在采樣時(shí)間點(diǎn)設(shè)計(jì)上予以考慮。此外，還應(yīng)該針對(duì)不同分析模式的特殊性，考察方法的穩(wěn)健程度，例如細(xì)胞代次等。 

通常，基于細(xì)胞的中和活性檢測(cè)方法采用特定濃度的陽性抗體及特定濃度的藥物。因此，應(yīng)對(duì)藥物的濃度進(jìn)行篩選，使其產(chǎn)生的細(xì)胞效應(yīng)對(duì)中和作用足夠靈敏。如果藥物的濃度在量效曲線的下半部分，可能沒有足夠的動(dòng)態(tài)范圍響應(yīng)以顯示中和效果。如果在接近量效曲線的平臺(tái)濃度下進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)于中和抗體含量低的樣本，可能檢測(cè)不出陽性結(jié)果。因此，建議選擇量效曲線線性范圍內(nèi)的藥物濃度進(jìn)行中和活性試驗(yàn)。 

樣本基質(zhì)可干擾中和活性試驗(yàn)，尤其在基于細(xì)胞的檢測(cè)中，基質(zhì)組分可能增強(qiáng)或抑制藥物的活性。例如，患有特定疾病受試者的血清中可能含有高水平的細(xì)胞因子，這些因子可能激活細(xì)胞，使其對(duì)原有刺激因子或藥物的應(yīng)答增強(qiáng)，從而影響中和抗體的檢測(cè)。因此，應(yīng)了解這些試驗(yàn)中的基質(zhì)影響并選擇可以被藥物特異性激活的細(xì)胞系，還可通過特異性抗體抑制或耗竭干擾因子。 

中和活性試驗(yàn)需采用未給藥受試者的樣本，通過試驗(yàn)變異性來確定臨界值。如果對(duì)篩選和確證試驗(yàn)中檢測(cè)為陽性的樣本進(jìn)行中和活性檢測(cè)，通常采用 1%的假陽性率。當(dāng)使用中和活性進(jìn)行篩選時(shí)，應(yīng)采用 5%的假陽性率。如果樣本變異程度導(dǎo)致中和抗體活性難以評(píng)估，可考慮其他方法，或開發(fā)能使變異性降低并獲得更準(zhǔn)確臨界值的方法。 

中和活性試驗(yàn)通常采用固定臨界值，基于藥物作用機(jī)制可采用信號(hào)抑制或刺激百分比來表示；亦可采用浮動(dòng)臨界值。 

中和活性試驗(yàn)一般僅對(duì)抗藥抗體陽性樣本進(jìn)行檢測(cè)，通常不需要確證研究。由于生物活性檢測(cè)具有一定的復(fù)雜性，某些情況下，需要進(jìn)一步確定受試者是否產(chǎn)生了真正的中和抗體，應(yīng)考慮以下方面：（1）不相關(guān)的抑制分子可能引起中和活性，從而難以確認(rèn)中和活性是由中和抗體還是其他抑制分子導(dǎo)致。若擔(dān)心存在非特異性抑制，應(yīng)考慮進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)。（2）除了藥物，細(xì)胞系可能對(duì)多種刺激產(chǎn)生應(yīng)答。在這種情況下，可在藥物存在時(shí)檢測(cè)中和抗體，此時(shí)中和抗體應(yīng)答會(huì)被特異性阻斷，而其它刺激引起的應(yīng)答不會(huì)被阻斷。（3）基質(zhì)含有的可溶性受體或內(nèi)源性藥物類似物可能導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果。在這種情況下，直接進(jìn)行基質(zhì)樣本的檢測(cè)或封閉基質(zhì)因子（若已知）有助于了解試驗(yàn)結(jié)果。（4）還應(yīng)考慮樣本中是否存在藥物，特別是半衰期較長(zhǎng)的藥物。 

四、附錄

（一）免疫原性多層級(jí)檢測(cè)策略示意圖 

（二）抗藥抗體檢測(cè)方法的開發(fā)與驗(yàn)證

1.陽性對(duì)照抗體 

作為評(píng)估方法學(xué)性能的關(guān)鍵試劑，陽性對(duì)照抗體直接影響檢測(cè)方法的靈敏度。理想狀況下，陽性對(duì)照抗體應(yīng)能夠反映藥物在受試個(gè)體中的免疫應(yīng)答情況。因此，選擇合適的陽性對(duì)照抗體對(duì)抗藥抗體檢測(cè)方法學(xué)的開發(fā)和驗(yàn)證至關(guān)重要。 

陽性對(duì)照抗體可通過免疫動(dòng)物或從商業(yè)公司購買獲得。一般選擇免疫動(dòng)物制備多克隆抗體作為陽性對(duì)照抗體。對(duì)于臨床研究，如可獲得人的抗藥抗體，則可考慮優(yōu)先采用。如對(duì)于治療性單克隆抗體，應(yīng)特別考慮陽性對(duì)照抗體的代表性，建議首先根據(jù)抗體的結(jié)構(gòu)類型（如嵌合、人源化或全人源）評(píng)估其在受試動(dòng)物或人體中可能產(chǎn)生的抗體所針對(duì)的結(jié)構(gòu)域或抗原表位，然后選擇合適的免疫原針對(duì)性地制備陽性對(duì)照抗體。作為備選，有時(shí)也可選用單個(gè)或多個(gè)單抗的組合作為陽性對(duì)照抗體。如面臨無法制備陽性對(duì)照抗體的特殊情況，可以考慮采用替代手段，但需闡明采用替代手段的科學(xué)性和合理性。當(dāng)檢測(cè)模式為橋連法時(shí)（如對(duì)于單抗類藥物），陽性對(duì)照抗體理論上無種屬限制和免疫球蛋白亞型限制，但應(yīng)注意IgG4亞型不適用。 

陽性對(duì)照抗體一經(jīng)確定，即可用于評(píng)價(jià)靈敏度、選擇性、特異性、重現(xiàn)性等方法學(xué)特性。在方法開發(fā)和驗(yàn)證過程中，應(yīng)采用陽性對(duì)照抗體制備高、中、低不同濃度的質(zhì)控或系統(tǒng)適用性對(duì)照。中濃度質(zhì)控有利于在方法學(xué)驗(yàn)證過程中評(píng)估方法學(xué)的精密度，考察在較寬的抗藥抗體濃度范圍內(nèi)方法學(xué)表現(xiàn)是否可被接受。對(duì)于常規(guī)的抗藥抗體檢測(cè)，監(jiān)測(cè)系統(tǒng)適用性可只用高、低濃度質(zhì)控樣品。建議高濃度陽性對(duì)照選擇沒有鉤狀效應(yīng)的信號(hào)曲線高端對(duì)應(yīng)的濃度，或者模擬樣本中預(yù)期最高濃度水平。中濃度陽性對(duì)照應(yīng)選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線中段濃度點(diǎn)。建議采用統(tǒng)計(jì)的方式確定低濃度陽性對(duì)照樣品的濃度，一般以1%的分析批拒絕率來進(jìn)行計(jì)算。對(duì)于非臨床研究，可根據(jù)靈敏度確定試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用1.5~2倍陰性對(duì)照或 1.5~2倍篩選臨界值儀器響應(yīng)值或其轉(zhuǎn)換值對(duì)應(yīng)的濃度作為低濃度陽性對(duì)照樣品。 

2.陰性對(duì)照 

為評(píng)價(jià)非特異性本底水平，方法學(xué)驗(yàn)證和樣本檢測(cè)中均需設(shè)置陰性對(duì)照。陰性對(duì)照為來自至少10例代表性未給藥個(gè)體基質(zhì)的混合物。由于分析前的變量可能對(duì)陰性對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果帶來影響，應(yīng)盡可能模擬待測(cè)樣本的基質(zhì)特點(diǎn)，如基質(zhì)種類（一般為血清或血漿）、種屬、性別、年齡和疾病背景等，并采用與待測(cè)樣本相同的預(yù)處理方式，如相同的抗凝劑、采樣體積、相似的制備方法和相同的儲(chǔ)存條件等。如在方法開發(fā)和早期驗(yàn)證試驗(yàn)階段暫時(shí)無法獲得符合上述條件的基質(zhì)，可以采用健康個(gè)體的基質(zhì)。當(dāng)獲得與待測(cè)樣本相同的未給藥群體的基質(zhì)時(shí)，應(yīng)對(duì)臨界值、靈敏度和選擇性等重要方法學(xué)參數(shù)進(jìn)行確認(rèn)。此外，應(yīng)對(duì)基質(zhì)中可能含有的預(yù)存抗體、可發(fā)生結(jié)合的蛋白、可溶性受體等因素進(jìn)行評(píng)估。 

陰性對(duì)照樣本的信號(hào)值應(yīng)當(dāng)?shù)陀诘咏诤Y選臨界值，并且能夠代表臨界值確定試驗(yàn)中個(gè)體樣本的信號(hào)波動(dòng)情況，如陰性對(duì)照的信號(hào)值遠(yuǎn)低于個(gè)體樣本信號(hào)的均值，則不能用于監(jiān)測(cè)方法的適用性。 

3.臨界值 

臨界值是將樣本定義為陽性或陰性結(jié)果的響應(yīng)水平。建立合適的臨界值可使產(chǎn)生假陰性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)最小化。 

臨界值可能受多種干擾物或基質(zhì)成分的影響，應(yīng)在方法開發(fā)早期考慮這些因素。由于來源于不同目標(biāo)人群和疾病狀態(tài)的樣本中含有的引起背景信號(hào)發(fā)生變化的因素各有不同，可能需要分別制定不同的臨界值。 

如果可行，應(yīng)采用未經(jīng)治療的受試者的樣本通過重復(fù)試驗(yàn)對(duì)檢測(cè)的變異程度進(jìn)行考察，并基于統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)臨界值進(jìn)行計(jì)算。在計(jì)算臨界值時(shí)應(yīng)考慮統(tǒng)計(jì)確定的離群值和真實(shí)陽性樣本的影響，并提供剔除任何數(shù)據(jù)點(diǎn)的理由和用于確定離群值的判斷方法。 

3.1 篩選臨界值 

篩選臨界值用于初步判定待測(cè)樣本為陰性或潛在陽性。篩選臨界值的確定應(yīng)基于多個(gè)空白個(gè)體基質(zhì)的響應(yīng)值，從科學(xué)（如生物統(tǒng)計(jì)學(xué)）的角度進(jìn)行綜合考慮。用于計(jì)算篩選臨界值的空白個(gè)體基質(zhì)的來源應(yīng)盡量來自給藥前的受試者或動(dòng)物，如選擇來源于其它群體的空白個(gè)體基質(zhì)應(yīng)進(jìn)行合理性論證。通常，非臨床研究應(yīng)選擇不少于 15 個(gè)，臨床研究應(yīng)選擇不少于 50 個(gè)空白個(gè)體基質(zhì)。臨床前研究中至少對(duì)分析人員、日期兩個(gè)實(shí)驗(yàn)變量進(jìn)行考察，臨床研究中，根據(jù)實(shí)際情況可能還需要對(duì)更多變量，例如儀器、固相載體等進(jìn)行考察，分析時(shí)各樣本均設(shè)置復(fù)孔。 

非臨床研究中，篩選臨界值應(yīng)基于至少 2 名分析員在至少 3 天進(jìn)行的 3 個(gè)分析批的響應(yīng)值（或基于陰性對(duì)照校正后的數(shù)值）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析獲得；臨床研究中，應(yīng)考察至少 2 名分析員在至少 3 天進(jìn)行的 6 個(gè)分析批。篩選臨界值的一種計(jì)算方法是采用空白個(gè)體95%百分位數(shù)的單側(cè)90%置信區(qū)間下限得到。計(jì)算臨界值的統(tǒng)計(jì)方法取決于數(shù)據(jù)的分布，例如，正態(tài)分布的 95%的百分位數(shù)可通過個(gè)體均值加上 1.645 倍的標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算；也可用其他方法計(jì)算95%的百分位數(shù)值，例如，使用中位數(shù)及中位數(shù)的絕對(duì)偏差代替均值與標(biāo)準(zhǔn)差，應(yīng)說明計(jì)算方法選擇的依據(jù)。不同批次間，陰性對(duì)照樣本的平均信號(hào)值可能是恒定的，也可能在不同的分析批、孔板或分析人員之間變化。當(dāng)這之間的平均值不同，但平均值的方差恒定時(shí)，可以運(yùn)用一種標(biāo)準(zhǔn)化因子來計(jì)算并用于檢測(cè)中。這種方式獲得的臨界值稱為浮動(dòng)臨界值，是最常用的臨界值類型。對(duì)于正態(tài)分布數(shù)據(jù)，當(dāng)均值為常數(shù)時(shí)，可以在試驗(yàn)驗(yàn)證過程中建立一個(gè)臨界值，即固定臨界值，該臨界值可直接用于研究中。通常不鼓勵(lì)采用固定臨界值，因?yàn)樗鼰o法對(duì)研究中陰性對(duì)照可能的變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)。當(dāng)平均值和方差均不同時(shí)，可能需要為每個(gè)分析批、孔板或分析人員計(jì)算臨界值，即動(dòng)態(tài)臨界值。然而，這種方法通常不實(shí)用，因?yàn)檫@需要包含更多的陰性對(duì)照樣本。如果數(shù)據(jù)顯示需要使用動(dòng)態(tài)臨界值時(shí)，應(yīng)考慮進(jìn)一步開發(fā)試驗(yàn)方法，而不是使用動(dòng)態(tài)臨界值。 

3.2 確證臨界值 

由于篩選臨界值通常允許至少5%的假陽性率，因此經(jīng)篩選試驗(yàn)判定為“疑似陽性”的樣本可能是非特異性的，需進(jìn)一步通過確證試驗(yàn)考察對(duì)藥物的特異性，并基于確證臨界值（以百分比抑制率表示）確定是否為陽性。在確證臨界值確定試驗(yàn)中，通常將某一特定濃度的受試藥物加入空白個(gè)體基質(zhì)，通過加入藥物的空白個(gè)體基質(zhì)復(fù)孔信號(hào)值與未加藥物空白個(gè)體基質(zhì)復(fù)孔信號(hào)值計(jì)算信號(hào)抑制率。在剔除離群值后，可選擇信號(hào)抑制率的99%百分位數(shù)的80%~90%單側(cè)置信區(qū)間的下限（即允許1%假陽性）作為確證臨界值。建議確證臨界值確定試驗(yàn)與篩選臨界值確定試驗(yàn)在同一個(gè)分析批或分析板上進(jìn)行。對(duì)空白基質(zhì)數(shù)量、考察變量和復(fù)孔檢測(cè)的要求與篩選臨界值確定試驗(yàn)相同。當(dāng)確證試驗(yàn)所采用的方法或平臺(tái)不同時(shí)，確證臨界值應(yīng)在獨(dú)立的分析批中參考上述方法進(jìn)行構(gòu)建。 

4.靈敏度 

方法靈敏度是指陽性對(duì)照樣品檢測(cè)結(jié)果持續(xù)為陽性或讀數(shù)等同于該檢測(cè)方法臨界值的最低濃度。為了在抗藥抗體水平達(dá)到對(duì)藥代動(dòng)力學(xué)、藥效動(dòng)力學(xué)、安全性或有效性產(chǎn)生影響之前被檢測(cè)到，分析方法應(yīng)具有足夠靈敏度。值得注意的是，方法靈敏度是通過陽性對(duì)照抗體建立的，可能無法完全代表特定受試者體內(nèi)的抗藥抗體應(yīng)答情況。陽性對(duì)照抗體通常為高親和力抗體，該抗體可能高估靈敏度。因此，方法靈敏度并不是為了確定受試者體內(nèi)抗藥抗體的絕對(duì)量，而是為了更全面地理解檢測(cè)方法的性能。由于靈敏度可能受樣本中殘留藥物的影響，因此考察在預(yù)期藥物濃度下的靈敏度是非常重要的。 

4.1 方法靈敏度 

靈敏度可通過多種方法計(jì)算。通常在混合空白生物基質(zhì)中按照不高于 2~3 倍的梯度稀釋陽性對(duì)照樣品（應(yīng)采用經(jīng)親和層析純化后的多抗或單抗）至系列（至少 5 個(gè)）已知濃度，然后確定或計(jì)算靈敏度，一種方法是在至少滿足一個(gè)濃度的響應(yīng)值低于篩選/確證臨界值的情況下，高于篩選/確證臨界值的最低濃度即為方法靈敏度；另一種方法是采用橫跨篩選 /確證臨界值的兩個(gè)點(diǎn)進(jìn)行截距法計(jì)算；還可以對(duì)各濃度的響應(yīng)值和濃度進(jìn)行曲線擬合，根據(jù)篩選/確證臨界值計(jì)算的陽性對(duì)照抗體濃度即為方法靈敏度。

建議以陽性對(duì)照抗體的加樣濃度乘以最小稀釋倍數(shù)后進(jìn)行靈敏度的報(bào)告。如果采用了一個(gè)以上陽性對(duì)照抗體，建議分別報(bào)告靈敏度。對(duì)于非臨床研究，方法靈敏度一般需達(dá)到 250~500 ng/mL；對(duì)于臨床研究，在篩選和確證試驗(yàn)中，IgG 和 IgM 型抗藥抗體的檢測(cè)靈敏度一般應(yīng)達(dá)到 100 ng/mL。在某些特定情況下，基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和以往的數(shù)據(jù)，靈敏度大于上述推薦值也是可以接受的；有文獻(xiàn)報(bào)道，低至 100 ng/mL 的抗藥抗體水平也可能導(dǎo)致臨床反應(yīng)，此時(shí)可考慮更低的靈敏度。IgE 型抗藥抗體的檢測(cè)靈敏度需達(dá)到幾百 pg/mL 或幾 ng/mL 級(jí)別。對(duì)于中和活性試驗(yàn)的檢測(cè)可能無法達(dá)到該靈敏度水平。方法靈敏度高度依賴于所采用的陽性對(duì)照抗體，不一定能直接反映待測(cè)樣本中的最低檢出水平；但靈敏度提供了分析方法的性能指標(biāo)，有助于在開發(fā)階段選擇最優(yōu)的抗藥抗體檢測(cè)方法。 

4.2 藥物耐受水平 

生物樣本中可能含有高濃度的游離受試藥物，可以與捕獲試劑/檢測(cè)試劑競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗藥抗體，進(jìn)而干擾抗藥抗體檢測(cè)導(dǎo)致假陰性結(jié)果。因此，在方法學(xué)早期開發(fā)過程中，應(yīng)評(píng)估游離受試藥物對(duì)方法學(xué)的干擾，即藥物耐受水平，并在方法學(xué)驗(yàn)證中進(jìn)行考察。 

藥物耐受水平需要結(jié)合待測(cè)樣本中的藥物濃度進(jìn)行考察。一般使用混合空白基質(zhì)稀釋受試藥物至合適系列濃度，用該系列稀釋樣本與不同濃度陽性對(duì)照抗體混合后進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)至少包含低濃度陽性對(duì)照抗體或者 100ng/mL 濃度的陽性對(duì)照抗體，非臨床研究中可適度考察更高濃度（250~500ng/mL）的陽性對(duì)照抗體。響應(yīng)值高于篩選臨界值所對(duì)應(yīng)的最高受試藥物濃度即為該濃度陽性對(duì)照抗體能夠耐受的最大藥物濃度，也可以使用橫跨篩選臨界值的兩個(gè)點(diǎn)進(jìn)行截距法計(jì)算，得到該濃度陽性對(duì)照抗體能夠耐受的最大藥物濃度。 

值得注意的是，藥物耐受水平數(shù)據(jù)僅代表某特定濃度的陽性對(duì)照抗體樣品對(duì)藥物的耐受特性，由于陽性對(duì)照抗體樣品與待測(cè)樣本中抗藥抗體的親和力存在差異，可能與待測(cè)樣本中抗藥抗體的藥物耐受性水平有所不同。 

在方法開發(fā)時(shí)，需對(duì)可能影響藥物耐受性的選擇性、靶點(diǎn)的性質(zhì)及陽性對(duì)照類型進(jìn)行考察。如對(duì)于不耐酸的抗體或可溶性靶點(diǎn)，酸解離可能并不適用?？赏ㄟ^采集受試者體內(nèi)藥物濃度達(dá)到谷濃度時(shí)的樣本來盡量降低藥物的干擾。 

5.精密度 

待測(cè)樣本的檢測(cè)通常是在不同的分析時(shí)間、分析批（板）、分析儀器及分析員之間進(jìn)行的，因此分析方法應(yīng)滿足相應(yīng)的精密度要求，并分別考察篩選試驗(yàn)精密度、確證試驗(yàn)精密度和滴度試驗(yàn)精密度。 

臨床、非臨床對(duì)精密度的考察類似，但臨床研究中的批間精密度考察會(huì)納入更多變量與分析批數(shù)量。對(duì)于篩選和確證試驗(yàn)，建議在不同的時(shí)間、由不同的分析人員、使用相同的儀器或平臺(tái)和相同的數(shù)據(jù)模型評(píng)估批間精密度。臨床研究中通過至少 6 個(gè)分析批進(jìn)行批間精密度評(píng)估，非臨床研究至少需要 3 個(gè)分析批。批內(nèi)精密度一般來源于含至少 6 套獨(dú)立配制的系統(tǒng)適用性對(duì)照樣品的分析批數(shù)據(jù)，通過系統(tǒng)適用性樣品（陰性對(duì)照、低濃度陽性對(duì)照、中濃度陽性對(duì)照、高濃度陽性對(duì)照以及確證試驗(yàn)的免疫耗竭對(duì)照）的變異系數(shù)（%CV）來呈現(xiàn)，其中陽性對(duì)照樣品需要采用與分析方法相同的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換方式來計(jì)算，不宜高于 20%。批間精密度通過所有可報(bào)告的驗(yàn)證分析批系統(tǒng)適用性樣品（陰性對(duì)照、低濃度陽性對(duì)照、中濃度陽性對(duì)照、高濃度陽性對(duì)照以及確證試驗(yàn)的免疫耗竭對(duì)照）的變異系數(shù)（%CV）來呈現(xiàn)，其中陽性對(duì)照樣品需要采用與分析方法相同的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換方式來計(jì)算，不宜高于 20%；若高于 20%需要優(yōu)化分析方法或提供合理性說明；對(duì)于陰性對(duì)照樣品或高變異度的細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)，其接受標(biāo)準(zhǔn)可適度放寬。對(duì)于滴度試驗(yàn)，批內(nèi)精密度建議通過含有至少 3 套獨(dú)立配制的滴度陽性對(duì)照樣品進(jìn)行評(píng)估，批間精密度建議通過至少 3 個(gè)分析批至少 9 套滴度陽性對(duì)照樣品進(jìn)行評(píng)估。 

6.特異性 

特異性是指某種方法對(duì)于某一目標(biāo)分析物的專屬檢測(cè)能力，特異性較低可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果。所開發(fā)的分析方法應(yīng)能夠特異性地檢測(cè)抗藥抗體，而非單抗藥物、可溶性靶點(diǎn)、非特異性內(nèi)源性抗體或方法中使用的抗體試劑。類似地，對(duì)于類風(fēng)濕因子高發(fā)的人群，應(yīng)證明類風(fēng)濕因子不會(huì)干擾分析方法或該方法能夠區(qū)分出類風(fēng)濕因子和特定抗體。如果抗藥抗體可與宿主細(xì)胞蛋白或其他產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)，可能需要對(duì)這些反應(yīng)的特異性進(jìn)行評(píng)估。應(yīng)根據(jù)非臨床與臨床試驗(yàn)不同階段的具體情況考察方法特異性?？疾熘笜?biāo)包括但不限于血清中的因子（如類風(fēng)濕因子）、脂質(zhì)、血紅蛋白、預(yù)存抗體和/或合并用藥等對(duì)方法的干擾作用。應(yīng)采用添加或未添加藥物或其相關(guān)物質(zhì)的陰性對(duì)照樣品和低濃度陽性對(duì)照樣品進(jìn)行特異性考察。 

7.選擇性 

選擇性是指分析方法能夠在樣本中存在其他成分的情況下檢出特異性針對(duì)該藥物的抗藥抗體的能力。待測(cè)基質(zhì)中往往含有大量的不同大小和不同電荷的蛋白質(zhì)，可能對(duì)抗藥抗體的檢測(cè)造成干擾。如未對(duì)分析方法的選擇性進(jìn)行驗(yàn)證易造成非特異性信號(hào)，從而導(dǎo)致無法正常檢出陽性樣本。 

通常需要對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行稀釋處理以獲得較為理想的抗藥抗體檢測(cè)能力。最小稀釋倍數(shù)有多種定義，包括：產(chǎn)生最高信噪比的樣本稀釋倍數(shù)，產(chǎn)生最接近稀釋液的信號(hào)的樣本稀釋倍數(shù)，以及導(dǎo)致最高信號(hào)變量比的樣本稀釋倍數(shù)，可使用上述定義中的任何一種，但是為了有效計(jì)算方法的靈敏度，最小稀釋倍數(shù)應(yīng)該考慮待測(cè)樣本的最終稀釋程度，通常為 1:5 至 1:100 （即 1/5 到 1/100）。建議最小稀釋倍數(shù)不要超過 1:100，因?yàn)檫^高的最小稀釋倍數(shù)可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。在某些情況下，如采用了更高的最小稀釋倍數(shù)，應(yīng)充分考慮其對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響以及產(chǎn)品的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。建議通過一定數(shù)量的未給藥受試者樣本來確定最小稀釋倍數(shù)。最小稀釋倍數(shù)的確定通常需要連續(xù)稀釋不含藥的抗藥抗體陰性樣本，以及通過將已知濃度的陽性對(duì)照抗體經(jīng)系列稀釋后加入基質(zhì)配制至高、中、低濃度，與使用稀釋液配制的相同濃度的陽性對(duì)照抗體進(jìn)行對(duì)比。最小稀釋倍數(shù)應(yīng)使用適當(dāng)數(shù)量的個(gè)體血清樣本來計(jì)算，樣本的數(shù)量取決于個(gè)體樣本的變異性等多種因素；一般推薦至少采用 10 個(gè)樣本。 

方法學(xué)驗(yàn)證時(shí)，篩選試驗(yàn)、確證試驗(yàn)中采用至少 10 個(gè)空白個(gè)體基質(zhì)在空白水平、低濃度陽性對(duì)照水平考察選擇性，確保至少80%個(gè)體的選擇性考察結(jié)果符合方法學(xué)驗(yàn)證的預(yù)期接受標(biāo)準(zhǔn)。有些情況下，需考察溶血或高脂對(duì)樣本檢測(cè)的影響。 

8.鉤狀效應(yīng) 

鉤狀效應(yīng)是指由于存在高濃度的特異性的被分析物或者抗體，出現(xiàn)信號(hào)值減少，從而可能導(dǎo)致假陰性信號(hào)。非臨床研究和臨床研究中，應(yīng)考察是否出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)。一般，通過在混合基質(zhì)中加入陽性對(duì)照抗體進(jìn)行一系列稀釋的方法來進(jìn)行評(píng)估。 

9.其他驗(yàn)證內(nèi)容 

在某些特定條件下尚需對(duì)試驗(yàn)的重現(xiàn)性、穩(wěn)健性、穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證。 

9.1 重現(xiàn)性 

如果在研究期間樣本由兩個(gè)或多個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)，重現(xiàn)性是重要的考量因素，應(yīng)保證不同實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生的數(shù)據(jù)具有可比性。應(yīng)在實(shí)驗(yàn)室之間建立可比較的方法性能，包括臨界值，靈敏度，藥物耐受性，精密度等。 

9.2 穩(wěn)健性和穩(wěn)定性 

方法穩(wěn)健性表明了檢測(cè)方法在正常使用期間的可靠性，應(yīng)不受方法中微小調(diào)整及儀器性能的影響。生物學(xué)分析方法的復(fù)雜性使其特別容易受到檢測(cè)條件變化的影響，因此評(píng)估和優(yōu)化細(xì)胞傳代數(shù)、孵育時(shí)間和培養(yǎng)基成分等參數(shù)至關(guān)重要。應(yīng)該在開發(fā)階段檢測(cè)方法穩(wěn)健性，如果分析中特定步驟中的微小變化影響結(jié)果，則應(yīng)該采取預(yù)防措施來控制該步驟。 

樣品穩(wěn)定性有時(shí)也需要進(jìn)行驗(yàn)證。由于考察受試者樣本的穩(wěn)定性通常是不可行的，因此建議保存受試者樣本的方式與保存陽性抗體的方式一致。可通過對(duì)受試者的樣本適當(dāng)分裝來減少凍融循環(huán)。評(píng)估短期穩(wěn)定性的研究，包括凍融循環(huán)和陽性對(duì)照樣品在冰箱中和室溫條件下的穩(wěn)定性，是有意義的。 

（三）體外細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)

細(xì)胞因子釋放綜合征為免疫細(xì)胞過度活化，促炎性因子快速釋放而導(dǎo)致的一組臨床綜合癥，是免疫調(diào)節(jié)類藥物普遍的不良反應(yīng)。對(duì)于免疫調(diào)節(jié)類藥物，完整的非臨床評(píng)價(jià)需要整合所有可用的體內(nèi)和體外試驗(yàn)數(shù)據(jù)。除了在常規(guī)的動(dòng)物體內(nèi)毒性試驗(yàn)中進(jìn)行細(xì)胞因子相關(guān)檢測(cè)外，還應(yīng)進(jìn)行體外細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)。采用人全血或人外周血單個(gè)核細(xì)胞體外評(píng)價(jià)細(xì)胞活化和細(xì)胞因子的釋放，可在一定程度上彌補(bǔ)因種屬差異導(dǎo)致的動(dòng)物模型無法完全模擬人體免疫激發(fā)過程的缺陷。當(dāng)體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果為陰性時(shí)，體外試驗(yàn)陽性結(jié)果可以提示潛在臨床安全風(fēng)險(xiǎn)。建議基于細(xì)胞因子釋放機(jī)制設(shè)計(jì)合適的體外細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)。通常應(yīng)考慮采用液相和固相兩種孵育系統(tǒng)。如果藥物直接靶向免疫細(xì)胞，可采用外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。如果機(jī)制可能與 FcγRs 結(jié)合相關(guān)，則更適合在包含表達(dá) FcγRs 的細(xì)胞的全血中進(jìn)行試驗(yàn)。如果靶抗原僅在疾病狀態(tài)表達(dá)，或者機(jī)制涉及在全血或外周血單個(gè)核細(xì)胞中不存在的細(xì)胞類型，可以考慮在檢測(cè)系統(tǒng)中引入腫瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞系或原代細(xì)胞。體外細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)應(yīng)設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，陽性對(duì)照應(yīng)采用在測(cè)試體系中細(xì)胞因子釋放明顯的已知藥物，應(yīng)優(yōu)先考慮與受試藥物細(xì)胞因子釋放的預(yù)期機(jī)制類似者。細(xì)胞因子的檢測(cè)項(xiàng)目應(yīng)與受試藥物臨床安全性考慮密切相關(guān)，一般情況下，觀察指標(biāo)包括但不限于 IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ 和 TNF-α。