精準(zhǔn)評(píng)估m(xù)RNA完整性對(duì)于獲得可靠的基因表達(dá)數(shù)據(jù)至關(guān)重要，如在臨床和分子研究中的RT-qPCR或RNA測(cè)序分析表達(dá)譜。由于mRNA僅占RNA總量的5%，而核糖體RNA（rRNA）占了最大的比重，因此評(píng)估m(xù)RNA完整性的技術(shù)應(yīng)該是針對(duì)mRNA本身。另外，RNA提取的污染物也可能導(dǎo)致檢測(cè)偏差。
RNA完整性最早通過檢測(cè)瓊脂糖凝膠上的28S和18S rRNA條帶來(lái)進(jìn)行評(píng)估，但該技術(shù)上樣量大(~300ng)、耗時(shí)、無(wú)法準(zhǔn)確定量且不確定性強(qiáng)。毛細(xì)管電泳系統(tǒng)出現(xiàn)后，實(shí)現(xiàn)了用快速、可重復(fù)和自動(dòng)化的方式進(jìn)行RNA完整性評(píng)估，但很大程度上評(píng)估的是核糖體18S和28S RNA而不是mRNA本身的定量和完整性，因此作為完整性指標(biāo)存在爭(zhēng)議。基于3':5'的逆轉(zhuǎn)錄定量PCR (RT-qPCR) 可以直接測(cè)定mRNA的完整性，成為毛細(xì)管電泳的替代方法，但標(biāo)準(zhǔn)曲線的使用和PCR抑制劑的存在導(dǎo)致方法過程繁瑣和結(jié)果的不穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)首次通過數(shù)字PCR技術(shù)可以對(duì)mRNA進(jìn)行完整性檢測(cè)，同時(shí)實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量，由比利時(shí)根特大學(xué)和澳大利亞的科學(xué)家在《Analytical Biochemistry》發(fā)表了題為“Development of a 3':5' digital PCR assay to determine horse mRNA integrity”的文章。文中采用3':5'的三重?cái)?shù)字PCR直接絕對(duì)定量檢測(cè)方法，基于naica?微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)完成馬的mRNA完整性分析，整個(gè)方法快速準(zhǔn)確、直觀簡(jiǎn)便，為mRNA完整性評(píng)估提供極具應(yīng)用意義的檢測(cè)新方法。- 開發(fā)了一種快速，直觀，簡(jiǎn)便的三重?cái)?shù)字PCR 3':5'測(cè)定法，用于評(píng)估馬樣品中的mRNA完整性。
- 數(shù)字PCR檢測(cè)可以同時(shí)對(duì)mRNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量，不受抑制物影響。
- 數(shù)字PCR檢測(cè)靈敏度高，不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)特別適合少量樣本。
3':5'的PCR方法需要設(shè)3組引物/探針，分別用于擴(kuò)增靶標(biāo)基因的3'端、中心和5'端序列(如下圖所示)。由于逆轉(zhuǎn)錄酶在斷點(diǎn)后無(wú)法繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，因此 mRNA的完整性直接影響三個(gè)區(qū)域中每個(gè)區(qū)域的逆轉(zhuǎn)錄。完整性高的mRNA 3':5'拷貝數(shù)濃度比例接近1：1，而完整性低的mRNA 5'端拷貝數(shù)濃度會(huì)比3'端少，3':5'的比值更高。
3'：5'三重數(shù)字PCR檢測(cè)mRNA完整性的原理示意圖
三組引物和探針分別針對(duì)所選基因的3 '端、中心和5 '端，具有高完整性的mRNA會(huì)轉(zhuǎn)錄所有區(qū)域，而完整性差的mRNA只會(huì)轉(zhuǎn)錄3 '區(qū)域(紅色信號(hào))。本研究使用以PGK1作為靶序列，該基因編碼磷酸甘油酸激酶-1，RNA分離后，對(duì)照組使用加熱或酶解的方式對(duì)RNA進(jìn)行降解。逆轉(zhuǎn)錄結(jié)束后使用預(yù)先設(shè)計(jì)的針對(duì)3'端、中心端和5'端和3對(duì)引物/探針進(jìn)行三重?cái)?shù)字PCR擴(kuò)增檢測(cè)。3'：5'三重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)mRNA完整性的擴(kuò)增子距離示意圖多重引物探針設(shè)計(jì)和方法優(yōu)化可登陸Gene-π數(shù)字PCR在線資源中心通過基于naica?微滴數(shù)字PCR系統(tǒng)的三重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)方法，將24個(gè)樣本的檢測(cè)結(jié)果與對(duì)應(yīng)的RIN值進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合分析，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。通過線性回歸模型校正分析相關(guān)性，通過數(shù)據(jù)集進(jìn)行穩(wěn)健回歸以檢驗(yàn)異常值。數(shù)據(jù)表明，3':5'三重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)結(jié)果的線性回歸分析具高擬合度(藍(lán)色R2)，是評(píng)估RNA完整性的可靠方法。
3'：5'數(shù)字PCR檢測(cè)mRNA完整性的結(jié)果驗(yàn)證3 ':5 'naica三重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性研究。1)去除異常值（紅色）的線性回歸模型(藍(lán)色)，2)整個(gè)數(shù)據(jù)集的穩(wěn)健回歸模型(橙色)。
本研究中開發(fā)了一種 3':5' 三重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)方法，使用更快速、直觀、簡(jiǎn)便數(shù)字PCR方法研究mRNA的完整性。數(shù)字PCR檢測(cè)結(jié)果與RIN結(jié)果高度相關(guān)。本文首次證明數(shù)字PCR 是評(píng)估RNA完整性的一種有應(yīng)用前景的新方法。而且數(shù)字PCR 可以實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量，因此同時(shí)可以用于評(píng)估逆轉(zhuǎn)錄mRNA 的實(shí)際用量。
1.Charis Du Cheyne,Development of a 3’:5’ digital PCR assay to determine horse mRNA integrity,Analytical Biochemistry,Volume 626,2021,114217,2.The dMIQE Group, J.F. Huggett, The digital MIQE guidelines update: minimum information for publication of quantitative digital PCR experiments for 2020, Clin. Chem. 66 (2020) 1012–1029.3.https://www.gene-pi.com/tutorials/
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