基因治療載體一般可分為病毒性載體和非病毒性載體兩大類。根據(jù)Cortellis數(shù)據(jù)庫資料顯示，截止2022年全球共有1562個(gè)基因治療藥物上市或在臨床研究階段；其中以腺病毒相關(guān)病毒（AAV）為載體進(jìn)行的基因遞送藥物研究超過800項(xiàng)（圖一）。用于基因治療的重組腺相關(guān)病毒載體（rAAV）是在非致病的野生型 AAV基礎(chǔ)上經(jīng)多輪生物工程改造形成的，具有如下4個(gè)特點(diǎn)：（1）較高的生物安全級別：rAAV是缺陷型病毒載體，目前尚未發(fā)現(xiàn)rAAV能夠?qū)е氯祟惣膊?；?）較強(qiáng)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)能力：rAAV對分裂/非分裂細(xì)胞均有較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，實(shí)現(xiàn)其攜帶基因的表達(dá)；（3）獨(dú)特的組織特異性：不同血清型rAAV能夠?qū)Σ煌M織進(jìn)行特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的體內(nèi)表達(dá)；（4）持久的表達(dá)潛能：rAAV能夠長期穩(wěn)定存在于宿主細(xì)胞中，具有持久的表達(dá)潛力。然而在以CRISPR為基礎(chǔ)的基因治療中，運(yùn)用AAV病毒進(jìn)行體內(nèi)遞送存在一些明顯劣勢，例如AAV病毒的包裝容量約4.7kb，當(dāng)插入的DNA長度接近4.7Kb時(shí)，包裝效率會顯著降低，這導(dǎo)致AAV無法通過單一載體形式對堿基序列較長的堿基編輯器和先導(dǎo)編輯器等進(jìn)行包裝；AAV病毒在體內(nèi)表達(dá)時(shí)間較長，更易引發(fā)Cas9蛋白的脫靶效應(yīng)；另外，AAV病毒可少量地整合到宿主基因組DNA中，有利的方面是可以增加療效的持久性，不利的方面是理論上有導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的可能性存在（但實(shí)際情況來看，其概率很低），目前的大量臨床試驗(yàn)還未見此副作用的報(bào)道。基于上述原因，在實(shí)際臨床應(yīng)用中，更偏向于將Cas9以mRNA或蛋白的形式瞬時(shí)遞送到人體中。因此，以非病毒的納米顆粒為載體的遞送方式也被應(yīng)用到臨床中，例如Intellia Therapeutics公司2021年公布用于治療轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性（ATTR）的NTLA-2001 療法，就是通過脂質(zhì)納米顆粒（LNP）載體，將攜帶靶向致病基因 TTR的 sgRNA 和優(yōu)化的 SpCas9 蛋白的 mRNA 序列，遞送至肝臟。由于LNP是通過內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞，且不易從內(nèi)吞體逃逸出來，因此LNP遞送效率低于AAV載體。金納米顆粒與內(nèi)吞體破壞聚合物的復(fù)合物具有逃逸內(nèi)吞體的能力，并已用于將CRISPR RNP遞送到人血液祖細(xì)胞以及小鼠肌肉和大腦；然而，這種類型的納米材料可以在肝臟和脾臟中積累兩個(gè)多月，并顯著改變幾個(gè)途徑的基因表達(dá)模式。由于AAV和納米顆粒為載體的基因治療策略各有優(yōu)缺點(diǎn)，開發(fā)新型的基因遞送方式已成為近年來的熱點(diǎn)研究方向，病毒樣顆粒 (VLP) 是一種可以感染細(xì)胞但缺乏病毒遺傳物質(zhì)的病毒蛋白組裝體，VLP可以遞送mRNA、蛋白質(zhì)或者核糖核蛋白（RNP）。VLP來源于病毒支架，可利用病毒特性實(shí)現(xiàn)有效的細(xì)胞內(nèi)遞送，具有封裝藥物、內(nèi)涵體逃逸的功能，經(jīng)設(shè)計(jì)可靶向不同的細(xì)胞類型。本文將著重介紹類病毒載體（VLP）的研究進(jìn)展及應(yīng)用潛力。
圖一、在研的基因治療藥物統(tǒng)計(jì)
目前報(bào)道的用于遞送mRNA或蛋白的VLP都是基于逆轉(zhuǎn)錄病毒，由于未成熟的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒缺乏剛性對稱結(jié)構(gòu)，因此可提高封裝藥物的靈活性。此外，逆轉(zhuǎn)錄病毒直徑約為100-200 nm，可為裝載mRNA或蛋白提供充分的空間。最后，逆轉(zhuǎn)錄病毒還可通過調(diào)節(jié)其包膜蛋白的組成實(shí)現(xiàn)細(xì)胞靶向性遞送。逆轉(zhuǎn)錄病毒含有兩份線性單鏈RNA，編碼Gag, pol和env基因。Gag包含組成病毒中心和結(jié)構(gòu)蛋白的基因，如基質(zhì)蛋白（MA）, 衣殼蛋白（CA）和核衣殼（NC）。Pol表達(dá)的是Pol多聚蛋白，編碼逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）、蛋白酶（PR）和整合酶（IN）。env基因表達(dá)表面包膜糖蛋白（SU）和跨膜（TM）糖蛋白（圖二）。逆轉(zhuǎn)錄病毒在結(jié)合并穿透宿主細(xì)胞后，病毒 RNA 被轉(zhuǎn)錄成DNA，然后經(jīng)由使用宿主和病毒編碼的蛋白整合到宿主 DNA 中；在合成和組裝之后，此復(fù)制過程導(dǎo)致感染性病毒顆粒的釋出（圖三）。
圖二、逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)果圖（http://www.labome.cn/method/Nucleic-Acid-Delivery-Lentiviral-and-Retroviral-Vectors.html）
在基于逆轉(zhuǎn)錄病毒的遞送載體中，為提高病毒的宿主范圍，表達(dá)水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）基因的序列已用于代替原病毒的env基因。除此之外，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中Ψ和 LTR序列分別是將基因包裝到病毒體和整合到宿主所必須的。由于逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒缺乏剛性對稱結(jié)構(gòu)，通過將感興趣的外源基因融合到 Gag 和 Pol基因的 N 端，已被證明可將外源基因摻入到病毒顆粒中，并在病毒顆粒成熟期間以蛋白酶依賴性方式從病毒多肽中釋放出來（圖三）。
本文所介紹的類病毒載體正是基于上述逆轉(zhuǎn)錄病毒的這些特點(diǎn)。由于類病毒缺乏LTR和整合酶，借用逆轉(zhuǎn)錄病毒中的一些結(jié)構(gòu)元件，如Gag 和 Pol基因，將目的基因瞬時(shí)表達(dá)在細(xì)胞中，除此之外，類病毒也可通過整合一些RNA結(jié)合蛋白，實(shí)現(xiàn)大蛋白的包裝，突破AAV病毒的包裝瓶頸。類病毒病毒包裝過程與常用的慢病毒和AAV病毒相似，僅需將不同的類病毒元件分別表達(dá)到293T細(xì)胞中，然后進(jìn)行病毒純化和濃縮。由于不同類病毒的設(shè)計(jì)原理各不相同，本文將通過下列三種形式類病毒進(jìn)行分別介紹。
1. VLP-mRNA
2021年蔡宇伽團(tuán)隊(duì)在Nature biomedical engineering 中報(bào)道了其自主研發(fā)的VLP-mRNA技術(shù)，該技術(shù)利用慢病毒包裝和mRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)與噬菌體衣殼蛋白特異識別等原理，可同時(shí)兼具病毒識別宿主廣譜性及mRNA表達(dá)瞬時(shí)性等特點(diǎn)（圖四）。研究發(fā)現(xiàn)Cas9 mRNA通過VLP-mRNA遞送，其體內(nèi)存在時(shí)間約為72小時(shí)。因此，與長時(shí)間表達(dá)Cas9的病毒系統(tǒng)相比，VLP-mRNA可以顯著降低脫靶效應(yīng)。另外，VLP-mRNA可以遞送整個(gè)CRISPR元件（Cas9與gRNA），克服了AAV載體運(yùn)載能力小的限制。目前，VLP-mRNA已經(jīng)在小鼠模型中證明可用于治療皰疹性基質(zhì)性角膜炎（HSK）。基于VLP-mRNA技術(shù)創(chuàng)建的本導(dǎo)基因公司，目前已針對包括病毒性角膜炎、地中海貧血和血友病在內(nèi)的多種疾病進(jìn)行臨床前研究。
圖四、VLP-mRNA技術(shù)原理。將MS2噬菌體衣殼蛋白編碼基因MS2C添加到Gag基因N端，在目的基因的C端添加mRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)MS2； 由于MS2與MS2C存在相互作用，且IN整合酶活性喪失，因此通過VLP-mRNA可實(shí)現(xiàn)目的基因的病毒包裝和瞬時(shí)表達(dá)。
2.SEND
SEND系統(tǒng)于2021年被張峰課題組構(gòu)建，其核心是PEG10蛋白。PEG10作為Gag基因同源物，數(shù)百萬年前就與人類祖先基因組整合在一起。PEG10蛋白可與自己的mRNA結(jié)合，并在其周圍形成一個(gè)球形的保護(hù)囊。張峰團(tuán)隊(duì)通過對PEG10與 mRNA結(jié)合機(jī)制進(jìn)行深入研究發(fā)現(xiàn)PEG10可通過結(jié)合其5'和3'端UTR序列，實(shí)現(xiàn)對插入到 5'和3'端UTR序列之間的目的序列進(jìn)行封裝。為實(shí)現(xiàn)形成的PEG10膠囊可進(jìn)入細(xì)胞，衣殼蛋白如VSV-G和SYNA等融合素蛋白（Fusogen）可對其進(jìn)行進(jìn)一步修飾。通過應(yīng)用類似于慢病毒包裝的三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)，PEG10可實(shí)現(xiàn)目的基因的體內(nèi)遞送（圖五）。由于SEND系統(tǒng)可由體內(nèi)自然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)組成，因此它可能不會觸發(fā)免疫反應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)重復(fù)給藥。2022年，張峰基于SEND技術(shù)創(chuàng)建了Aera Therapeutics公司，并實(shí)現(xiàn)2億美元的融資，該團(tuán)隊(duì)計(jì)劃未來在動物中測試SEND遞送能力，并對其進(jìn)行改造設(shè)計(jì)，以實(shí)現(xiàn)遞送的靶向性。
3. eVLP
2022年，David Liu課題組在Cell發(fā)布了該團(tuán)隊(duì)開發(fā)的一種工程化無DNA病毒樣顆粒（eVLP），能有效包裝和遞送堿基編輯器或Cas9核糖核蛋白。由于逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒缺乏剛性對稱結(jié)構(gòu)，因此可以用于包裝一些外源蛋白?；诖耍芯咳藛T將外源基因如堿基編輯器ABE8e添加到Gag蛋白的N端，為方便ABE8e在病毒成熟后脫離，在ABE8e和Gag蛋白之間還融合了一段可被病毒蛋白酶切割的linker序列（圖六）。當(dāng)向293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染Gag–pol，Gag-ABE8e，sgRNA和VSV-G后，收集細(xì)胞上清便可獲得ABE8e-VLP病毒顆粒。通過將該病毒顆粒感染細(xì)胞便可實(shí)現(xiàn)基因編輯。該團(tuán)隊(duì)通過對eVLP結(jié)構(gòu)及包裝過程優(yōu)化，最終生成的第四代eVLP系統(tǒng)所能包裝的堿基編輯器RNP蛋白量比初始報(bào)道高 16倍。由于eVLP是無DNA的，可通過直接遞送基因編輯器RNP的形式發(fā)揮作用，脫靶性較小，另外RNP的在體內(nèi)的穩(wěn)定性低于mRNA，且每個(gè)mRNA拷貝可翻譯多個(gè)RNP蛋白，因此eVLP其脫靶性應(yīng)該低于瞬時(shí)表達(dá)mRNA；在體內(nèi)，eVLP遞送的堿基編輯可實(shí)現(xiàn)小鼠肝臟63%的細(xì)胞編輯，進(jìn)而將血清中PCSK9水平降低78%；eVLP遞送的堿基編輯還可明顯改善遺傳性失明小鼠模型的視覺。4.小結(jié)
此前，David Liu及其合作者在Cell雜志發(fā)表最新綜述文章，將類病毒顆粒作為除病毒載體和納米顆粒之外的第三種基因藥物遞送平臺進(jìn)行了詳細(xì)總結(jié)，盡管三種方法各存在優(yōu)缺點(diǎn)，但不可否認(rèn)的是，隨著對類病毒載體研究改造的深入及其獨(dú)特之處，其定會在今后的臨床試驗(yàn)中嶄露頭角。
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本文章來源于煙雨平生
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