CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品質(zhì)量控制檢測(cè)研究

及非臨床研究考慮要點(diǎn)

目         錄

一、引言

二、適用范圍

1、 本技術(shù)要點(diǎn)適用于哪類 CAR-T 細(xì)胞產(chǎn)品？

2、 本技術(shù)要點(diǎn)包括哪些內(nèi)容？

3、 本技術(shù)考慮要點(diǎn)的基本原則是什么？

三、原材料和輔料及其質(zhì)量控制

1、 CAR-T 細(xì)胞產(chǎn)品的原材料和輔料通常都要考慮哪些因素？

2、 轉(zhuǎn)導(dǎo) / 轉(zhuǎn)染 T 細(xì)胞的病毒載體 / 質(zhì)粒載體是否可按照原材料管理？

3、 如何進(jìn)行原材料和輔料的選擇和風(fēng)險(xiǎn)控制？

4、 在載體物質(zhì)或 CAR-T 細(xì)胞終產(chǎn)品中是否需要進(jìn)行原材料殘留的質(zhì)量檢測(cè)？

四、病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染載體制備及質(zhì)量控制

1、 轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染載體制備的起始原材料包括哪些或如何定義轉(zhuǎn)染載體的起始原材料？

2、 起始原材料要建立種子庫系統(tǒng)嗎？

3、 如何建立種子庫系統(tǒng)？如何確定各級(jí)種子庫的代次及數(shù)量？

4、 種子庫的質(zhì)量要求是什么？如何管理種子庫？

5、 如何考慮質(zhì)粒載體的生產(chǎn)工藝及規(guī)模？質(zhì)粒載體的質(zhì)量控制包括哪些？

6、 病毒載體的生產(chǎn)規(guī)模要設(shè)計(jì)多大？是否可以采用細(xì)胞培養(yǎng)皿進(jìn)行病毒載體的培養(yǎng)？關(guān)鍵工藝研究包括哪些？病毒載體制備過程中如何降低牛血清的風(fēng)險(xiǎn)？

7、 是否要進(jìn)行病毒載體生產(chǎn)終末細(xì)胞的檢定？

8、 如何開展病毒載體中的外源因子污染的檢測(cè)？

9、 病毒載體是否要純化？純化及濃縮工藝應(yīng)考慮哪些因素？純化的病毒載體如何保存？

10、 純化后的病毒載體的質(zhì)量控制檢測(cè)需要考慮哪些參數(shù)？

11、 采用何種方法進(jìn)行病毒載體的滴度測(cè)定？是否需要規(guī)定病毒載體的比活性？

12、 采用何種方法進(jìn)行 RCR/RCL 檢測(cè)？

13、 如何考慮病毒載體工藝雜質(zhì)質(zhì)量控制的要求？

14、 是否要開展病毒載體的穩(wěn)定性研究以及如何設(shè)定穩(wěn)定性評(píng)價(jià)參數(shù)？

15、 轉(zhuǎn)導(dǎo)載體是否允許外包加工？如何控制外包加工的轉(zhuǎn)導(dǎo)載體的質(zhì)量？

五、建立可提供 T 細(xì)胞的供體資質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)

1、 選擇 T 細(xì)胞供體的基本考慮是什么？

2、 細(xì)胞供體（者）應(yīng)進(jìn)行哪些傳染性疾病因子的檢測(cè)？應(yīng)采用何種方法檢測(cè)？

3、 自體細(xì)胞供體是否必須要進(jìn)行傳染性疾病因子篩查和檢測(cè)？

4、 如使用可建系的細(xì)胞制備 CAR-T 細(xì)胞，如何評(píng)估其供體及細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)？

5、 在臨床試驗(yàn)過程中如何進(jìn)一步開展供體資質(zhì)的研究？

六、CAR-T 細(xì)胞產(chǎn)品的生產(chǎn)、質(zhì)量控制研究及檢測(cè)

1、CAR-T 細(xì)胞產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝研究應(yīng)考慮哪些因素？

2、如何定義 CAR-T 細(xì)胞的批次及批量？

3、CAR-T 細(xì)胞產(chǎn)品的質(zhì)量控制研究及檢測(cè)至少應(yīng)包括哪些項(xiàng)目？應(yīng)如何設(shè)置這些質(zhì)控項(xiàng)目更符合CAR-T 細(xì)胞產(chǎn)品的特點(diǎn)？

4、選擇或建立質(zhì)量控制檢測(cè)方法時(shí)應(yīng)考慮哪些因素？如何制定其每一檢測(cè)項(xiàng)目的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)？

5、CAR-T 細(xì)胞產(chǎn)品如何留樣更為合理？為便于質(zhì)量檢測(cè)及留樣，是否可以將需在最終包裝中檢測(cè)的項(xiàng)目分裝在非最終包裝容器中？

6、是否要開展 CAR-T 細(xì)胞穩(wěn)定性研究？

七、CAR-T 細(xì)胞的非臨床研究

1、 非臨床研究的一般原則

2、 CAR-T 細(xì)胞產(chǎn)品的藥效學(xué)研究

3、 CAR-T 細(xì)胞產(chǎn)品的藥代動(dòng)力學(xué)（藥代）研究

4、 CAR-T 細(xì)胞產(chǎn)品的非臨床安全性研究

結(jié)束語

參考文獻(xiàn)

起草單位及起草人

提出意見及建議的單位

一   引言

嵌合抗原受體T細(xì)胞（Chimeric antigen receptor T cell，CAR-T），是指通過基因修飾技術(shù)，將帶有特異性抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域及T細(xì)胞激活信號(hào)的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入T細(xì)胞，使T細(xì)胞通過直接與腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗原相結(jié)合而激活，通過釋放穿孔素、顆粒酶素B等直接殺傷腫瘤細(xì)胞，同時(shí)還通過釋放細(xì)胞因子募集人體內(nèi)源性免疫細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞，從而達(dá)到治療腫瘤的目的，而且還可形成免疫記憶 T細(xì)胞從而獲得特異性的抗腫瘤長(zhǎng)效機(jī)制。目前， CAR-T細(xì)胞對(duì)多種血液腫瘤顯示了非常好的臨床效果，對(duì)實(shí)體瘤治療也表現(xiàn)出了非常大的潛力。 2017 年美國(guó)批準(zhǔn)了兩個(gè)分別針對(duì)急性B淋巴細(xì)胞白血病和B淋巴細(xì)胞瘤的CD19-CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品上市，CAR-T細(xì)胞治療已經(jīng)成為腫瘤免疫治療領(lǐng)域中新的國(guó)際研究熱點(diǎn)。我國(guó) CAR-T 研究也呈現(xiàn)蓬勃發(fā)展的態(tài)勢(shì)，已有眾多研究機(jī)構(gòu)及制藥公司投入到了CAR-T 細(xì)胞產(chǎn)品的研發(fā)中，已有多家機(jī)構(gòu)遞交了CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品的臨床試驗(yàn)申請(qǐng)， CAR-T 細(xì)胞治療領(lǐng)域的產(chǎn)業(yè)化開始在千差萬別中起步。

同時(shí)，在CAR-T細(xì)胞治療研究熱潮的背后，我們必須要看到，盡管CAR-T細(xì)胞治療不斷取得令人鼓舞的進(jìn)展，但它還是一個(gè)新興領(lǐng)域，一方面人們對(duì)CAR-T細(xì)胞治療的科學(xué)認(rèn)識(shí)尚有許多需要解決的問題，另一方面又有許多新的技術(shù)不斷進(jìn)入該領(lǐng)域，且人們尚未有足夠的數(shù)據(jù)評(píng)估其潛在風(fēng)險(xiǎn)。此外細(xì)胞治療產(chǎn)品又具有與其它非體內(nèi)擴(kuò)增藥物完全不同的特點(diǎn)，不僅體現(xiàn)在個(gè)體化、產(chǎn)量小及批次有限等方面，而且存在起始材料差異大、制備工藝不成熟、生物學(xué)效力以及安全性評(píng)價(jià)復(fù)雜等問題，限制了CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品的快速發(fā)展，因此，如何提高CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品的安全性、有效性、質(zhì)量可控性以及產(chǎn)品工藝一致性是每一個(gè)研發(fā)者需要面臨的問題。

本技術(shù)考慮要點(diǎn)針對(duì)于國(guó)內(nèi)CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的研發(fā)現(xiàn)狀，以CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝及產(chǎn)品特性為主線，以《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》為基本要求，從如何開展CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的質(zhì)量控制檢測(cè)研究和非臨床評(píng)價(jià)兩個(gè)方面提出指導(dǎo)性意見，為CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品研發(fā)者提供技術(shù)參考，使我國(guó)CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品領(lǐng)域從起步即能夠按照一定的規(guī)范開展研究，為未來的產(chǎn)業(yè)化打好基礎(chǔ)。同時(shí)，本技術(shù)考慮要點(diǎn)也會(huì)隨著CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品各方面研究的不斷成熟而不斷進(jìn)行修訂，從而逐步建立更為科學(xué)合理的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的質(zhì)量控制檢測(cè)及非臨床評(píng)價(jià)的要求及標(biāo)準(zhǔn)。

二   適用范圍

1 本技術(shù)要點(diǎn)適用于哪類CAR- T細(xì)胞產(chǎn)品？

目前有多種方法用于T細(xì)胞修飾及CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品制備，包括病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)（如γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或慢病毒載體）及非病毒載體轉(zhuǎn)染（如mRNA 轉(zhuǎn)染、Transposons轉(zhuǎn)染等）等，雖然已開展的臨床試驗(yàn)中以病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式為主，但以非病毒載體轉(zhuǎn)染的方式也在不斷得到青睞，因此，本考慮要點(diǎn)主要以病毒載體和非病毒質(zhì)粒載體的基因修飾方式制備的CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品為主要對(duì)象，但共性的部分也可為其它類基因修飾方式制備的CAR-T細(xì)胞參考。

2 本技術(shù)要點(diǎn)包括哪些內(nèi)容？

本技術(shù)考慮要點(diǎn)按照CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的制備工藝順序，提出了各階段工藝研究及質(zhì)量控制的關(guān)注點(diǎn)及檢測(cè)要求的考慮，并提出了產(chǎn)品非臨床評(píng)價(jià)研究需要開展的內(nèi)容及所用方法，主要包括原輔料選擇、轉(zhuǎn)導(dǎo)基因載體或轉(zhuǎn)染基因載體的制備及質(zhì)量控制、細(xì)胞供體篩選及檢測(cè)、CAR-T細(xì)胞制備工藝研究、工藝過程控制、細(xì)胞產(chǎn)品質(zhì)量控制要求以及非臨床評(píng)價(jià)研究的動(dòng)物模型、有效性及安全性評(píng)價(jià)方法等，不僅提出一般要求，也對(duì)重點(diǎn)環(huán)節(jié)提出有針對(duì)性的考慮。

3 本技術(shù)考慮要點(diǎn)的基本原則是什么？

CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品是基因治療與細(xì)胞治療技術(shù)的結(jié)合，一方面，它具有基因治療可能潛在的風(fēng)險(xiǎn)，如因存在基因整合或細(xì)胞復(fù)制的可能而帶來二次腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)；另一方面，由于CAR-T細(xì)胞的制備是以人作為供體采集初始細(xì)胞材料才能進(jìn)入工藝過程，由于每個(gè)個(gè)體，特別是腫瘤患者，因其初始細(xì)胞會(huì)因?yàn)槟[瘤類別及所處分期、所接受過的治療、采集樣本時(shí)的身體狀況或與上一次治療的間隔時(shí)間、以及每個(gè)患者的T細(xì)胞的亞群的比例等有明顯的差異，即使采用已經(jīng)進(jìn)行過充分驗(yàn)證的工藝，仍然難以保證每個(gè)個(gè)體所制備的目的細(xì)胞都是一致的。因此，本技術(shù)考慮要點(diǎn)一方面要考慮產(chǎn)品的安全性及有效性，另一方面更從各個(gè)工藝階段突出一致性的要求，以最大限度地降低產(chǎn)品的可變性。

三   原材料和輔料及其質(zhì)量控制

1   CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的原材料和輔料通常都要考慮哪些因素？

生產(chǎn)CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的原材料是指其生產(chǎn)過程中所用的所有生物原材料和化學(xué)原材料，它們不是CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的目標(biāo)組成成分，如培養(yǎng)基、PBMC分離試劑、T細(xì)胞分選試劑、激活劑、細(xì)胞因子（如IL-2、IL-7及IL-15）、血清或血清替代物等。而CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的輔料是指其產(chǎn)品配方中所使用的輔助材料,是其細(xì)胞產(chǎn)品中的成分，如人血白蛋白、人血小板提取物、凍存液（如DMSO）等。

一個(gè)完整CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的制備過程包括基因載體物質(zhì)的制備及CAR-T細(xì)胞終產(chǎn)品的制備兩個(gè)大的生產(chǎn)環(huán)節(jié)，同時(shí)，載體物質(zhì)的制備又包括了質(zhì)粒載體制備和/或病毒載體制備工藝過程，因此，在考慮選擇原材料時(shí)，不僅要考慮CAR-T 細(xì)胞產(chǎn)品制備過程中所用的原材料，也要考慮基因載體物質(zhì)制備過程中所用的原材料（不包括生產(chǎn)的起始原材料，如細(xì)胞基質(zhì)和菌毒種），如細(xì)菌及細(xì)胞培養(yǎng)基、牛血清、添加因子、轉(zhuǎn)染試劑（如鈣轉(zhuǎn)試劑、PEI、Lipo2000等）以及核酸酶等等。如果在CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)過程中還使用了自制的試劑和材料，還要考慮制備這些自制試劑中所用的原材料。

在早期的基礎(chǔ)研究時(shí)，研究者對(duì)原材料及輔料的關(guān)注可能不足，但由于原材料和輔料對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量及安全性均有重要影響，因此，一旦準(zhǔn)備進(jìn)入產(chǎn)品開發(fā)階段，研發(fā)人員就要盡早開展原材料及輔料的評(píng)估及篩選，而且在臨床過程中要進(jìn)一步開展相關(guān)的研究，在確證性臨床前應(yīng)完成充分的質(zhì)量評(píng)估工作。

2 轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)染T細(xì)胞的病毒載體/質(zhì)粒載體是否可按照原材料管理？

CAR-T細(xì)胞是基因治療的ex vivo方式，通過病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)或質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染，將CAR基因轉(zhuǎn)入T細(xì)胞中從而獲得CAR-T細(xì)胞，雖然它們未轉(zhuǎn)染的部分在后續(xù)的T細(xì)胞擴(kuò)增及洗滌過程中經(jīng)驗(yàn)證可被去除，但其所攜帶的遺傳物質(zhì)則是CAR-T細(xì)胞的重要組成部分且是使T細(xì)胞具有腫瘤殺傷活性的重要基礎(chǔ)，這一點(diǎn)與生產(chǎn)中所用的原材料的特性完全不同，其質(zhì)量對(duì)CAR-T細(xì)胞具有重要影響，因此，轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)染T細(xì)胞的病毒載體/或質(zhì)粒載體按照產(chǎn)品的理念進(jìn)行管理更為合理。

但同時(shí)還需要考慮到，正是因其不直接進(jìn)入患者體內(nèi)，在后續(xù)的細(xì)胞擴(kuò)增及CAR-T制劑工藝中會(huì)有稀釋或洗滌步驟，因此，通過驗(yàn)證可證明后續(xù)工藝可以降低其殘留的風(fēng)險(xiǎn)，則可以結(jié)合工藝驗(yàn)證的結(jié)果制定更為合理的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

3 如何進(jìn)行原材料和輔料的選擇和風(fēng)險(xiǎn)控制？

在CAR-T細(xì)胞制備過程中使用的原材料有藥用級(jí)別的（如IL-2），也有非藥用級(jí)別的（如IL7）；有的原材料在國(guó)外被批準(zhǔn)用于藥品生產(chǎn)但尚未在國(guó)內(nèi)獲得注冊(cè)，如某種CD3/CD28磁珠；有的同一種試劑分別存在藥用級(jí)別和非藥用級(jí)別，非藥用級(jí)又分為GMP級(jí)別及研究用級(jí)別；有的試劑是生物源性材料，如病毒制備中會(huì)用到的牛血清和胰酶；有的試劑甚至要自行制備等，面對(duì)如此復(fù)雜的情況，CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的研究者就需要考慮采用何種方法選擇以及控制原材料。

原材料的選擇是基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的原則，通過風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估從而建立與之相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)控制策略，通常會(huì)有以下幾種考慮：

（1）在產(chǎn)品研發(fā)早期就開始設(shè)計(jì)所用原材料的類別并分析其可能的風(fēng)險(xiǎn)，可根據(jù)我國(guó)現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》三部中“生物制品生產(chǎn)用原材料及輔料質(zhì)量控制規(guī)程”及國(guó)外相關(guān)技術(shù)要求對(duì)原材料的風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)進(jìn)行評(píng)估并分類，同一種試劑或材料，優(yōu)先選擇低風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別的，如藥用無菌制劑優(yōu)于藥用制劑，藥用級(jí)優(yōu)先于非藥用級(jí)、GMP級(jí)優(yōu)先于非GMP 級(jí)、非動(dòng)物源性優(yōu)先于動(dòng)物源性材料等；

（2）根據(jù)對(duì)每一種原材料風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的結(jié)果建立相應(yīng)的質(zhì)量檢測(cè)項(xiàng)目、檢測(cè)方法及放行標(biāo)準(zhǔn)，并在產(chǎn)品研發(fā)過程中不斷分析關(guān)鍵原材料質(zhì)量對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響，并不斷改進(jìn)關(guān)鍵原材料的質(zhì)量要求；

（3）對(duì)于研究級(jí)別的生物源性的原材料，不僅要設(shè)置它們的安全性質(zhì)控項(xiàng)目，如無菌、內(nèi)毒素、支原體、分枝桿菌及外源病毒污染的檢測(cè)等，還要考慮它們的純度、效價(jià)或?qū)?xì)胞活化、增殖的生物學(xué)效力的質(zhì)控項(xiàng)目。動(dòng)物源性材料的質(zhì)量控制，如牛血清，需至少按照已有的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或要求進(jìn)行原材料質(zhì)控及放行；

（4）對(duì)于自行研制的原材料，如某種特殊要求的細(xì)胞因子，不僅需要建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，還需要有制備工藝及其工藝驗(yàn)證等數(shù)據(jù)支持，有的高風(fēng)險(xiǎn)的原材料甚至可能還會(huì)要求開展動(dòng)物體內(nèi)的安全性評(píng)估。此類原材料的檢測(cè)要求需要根據(jù)其使用方式、下游工藝的清除驗(yàn)證數(shù)據(jù)以及潛在風(fēng)險(xiǎn)來確定。

輔料的選擇及控制要求同樣是基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的原則，因輔料是與CAR-T產(chǎn)品一同進(jìn)入患者體內(nèi)，因此，選擇低風(fēng)險(xiǎn)的輔料以及嚴(yán)格控制輔料風(fēng)險(xiǎn)是基本原則，如一種輔料同時(shí)存在幾種風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)來源時(shí)，應(yīng)選用風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)低的輔料；對(duì)于高風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)的輔料,應(yīng)在產(chǎn)品研發(fā)的早期評(píng)價(jià)使用這些輔料的必要性, 并尋找其他替代物或替代來源。

4 在載體物質(zhì)或CAR- T細(xì)胞終產(chǎn)品中是否需要進(jìn)行原材料殘留的質(zhì)量檢測(cè)？

在載體物質(zhì)或CAR-T細(xì)胞終產(chǎn)品中是否進(jìn)行原材料的殘留控制，主要考慮兩個(gè)方面：一個(gè)是根據(jù)原材料的風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，評(píng)估載體純化工藝或 CAR-T細(xì)胞制備工藝對(duì)其去除的能力；二是對(duì)于風(fēng)險(xiǎn)高的原材料除了評(píng)估去除能力外，還需要在載體或CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品制備的最適工藝階段或終產(chǎn)品中進(jìn)行殘留量檢測(cè)的控制并建立控制標(biāo)準(zhǔn)，如慢病毒工藝中使用的降解DNA的核酸酶Benzonase的殘留控制，牛血清白蛋白殘留量的檢測(cè)等。

四   病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染載體制備及質(zhì)量控制

1 轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染載體制備的起始原材料包括哪些或如何定義轉(zhuǎn)染載體的起始原材料？

對(duì)于γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（如GALV）來說，通過多質(zhì)粒瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染一包裝細(xì)胞獲得具有感染性的病毒顆粒，再將此病毒感染另一包裝細(xì)胞，該包裝細(xì)胞已穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了可產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的病毒必需基因，因此，通過克隆篩選后，可獲得穩(wěn)定生產(chǎn)高滴度逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的細(xì)胞株，如可生產(chǎn) GALV病毒載體的PG13細(xì)胞，這一穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞即是生產(chǎn)病毒的起始原材料。

對(duì)于慢病毒載體來說，多采用三質(zhì)?；蛩馁|(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞（如293T/17或293T細(xì)胞）的方法制備病毒載體，在這個(gè)體系中，含有CAR基因的穿梭載體、慢病毒包裝輔助元件的二個(gè)或三個(gè)輔助質(zhì)粒載體以及包裝細(xì)胞均是制備慢病毒載體的起始原材料。但同時(shí)，對(duì)于這些含有不同目的基因的質(zhì)粒來說，菌種又是質(zhì)粒生產(chǎn)的起始原材料，所以對(duì)于慢病毒載體，其起始原材料的定義要延伸到制備質(zhì)粒的菌種，質(zhì)粒在此系統(tǒng)中為慢病毒制備的中間產(chǎn)物。未來如果研究者可以開發(fā)出生產(chǎn)慢病毒的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，此時(shí)，就可以將慢病毒的起始原材料僅定義為細(xì)胞。

對(duì)于使用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)（如Piggybac）的非病毒載體，其起始原材料是指生產(chǎn)含CAR基因質(zhì)粒的菌種。

2 起始原材料要建立種子庫系統(tǒng)嗎？

是的。對(duì)于能夠建立庫系統(tǒng)的起始原材料，均應(yīng)采用二級(jí)或三級(jí)種子庫系統(tǒng)（種子、主庫和工作庫），因每一支凍存樣品均具有群體代表性，故種子庫具有良好的均質(zhì)性，而且可以進(jìn)行充分的質(zhì)量檢定，從而最大程度地控制污染風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)，由于種子庫系統(tǒng)具有足夠的數(shù)量，可為長(zhǎng)期生產(chǎn)提供穩(wěn)定的來源，因此，采用種子庫系統(tǒng)是質(zhì)粒載體及病毒載體生產(chǎn)一致性的重要保證之一。

用于生產(chǎn)病毒載體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞（如含 CAR基因的PG13細(xì)胞）及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（如 HEK293、293T或293T/17）均需建立細(xì)胞庫系統(tǒng)，即細(xì)胞種子，MCB和/或WCB；用于制備非病毒轉(zhuǎn)染方式的質(zhì)粒、慢病毒載體所需的穿梭質(zhì)粒及輔助質(zhì)粒的細(xì)菌，均需建立菌種庫體系，即主種子庫和/或工作種子庫。因不同穿梭載體可使用相同的輔助質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)染獲得慢病毒載體，因此，輔助質(zhì)粒載體菌種種子批的保存數(shù)量可相應(yīng)增大。

如對(duì)原親本細(xì)胞進(jìn)行了克隆篩選、無血清馴化、基因改造等改變細(xì)胞特性的操作，應(yīng)通過在原細(xì)胞名稱后增加后綴等方式重新命名細(xì)胞，以區(qū)別于原細(xì)胞，并重新建立細(xì)胞庫用于病毒載體的生產(chǎn)。

此外，在構(gòu)建病毒載體穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞過程中使用的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞或包裝細(xì)胞亦建議采用細(xì)胞庫體系，并至少進(jìn)行細(xì)胞鑒別、細(xì)菌、真菌、支原體污染檢查及一般外源病毒污染的檢查。

3   如何建立種子庫系統(tǒng)？如何確定各級(jí)種子庫的代次及數(shù)量？

通常情況下，種子庫系統(tǒng)按照原始種子細(xì)胞種子、主庫及工作庫進(jìn)行管理，原始種子庫細(xì)胞種子用于制備主庫、主庫用于制備工作庫。當(dāng)每年的細(xì)胞的使用量不多時(shí)，可以采用種子和主庫兩級(jí)管理。用于生產(chǎn)的種子庫系統(tǒng)必須符合種子庫的質(zhì)量要求。

無論是建立菌種庫還是細(xì)胞庫，其重要的一點(diǎn)是保證均質(zhì)性，即從種子或主庫中取1支或幾支細(xì)菌或細(xì)胞復(fù)蘇，按照規(guī)定的培養(yǎng)條件擴(kuò)增到一定數(shù)量后，在同一次操作中，將處于相同倍增水平的細(xì)菌或細(xì)胞收集后重懸于保存液或凍存液中，合并于同一個(gè)容器，然后無菌分裝到菌種保存管或細(xì)胞凍存管中，并在適當(dāng)?shù)臈l件下保存。菌種庫或細(xì)胞庫應(yīng)選擇最穩(wěn)定的保存方法，如菌種盡可能以凍干的方式保存，細(xì)胞通常在液氮（如氣相）中保存，或超低溫保存（-180℃及以下）。以包裝慢病毒的293T/17細(xì)胞為例，將細(xì)胞種子復(fù)蘇后，按照固定的比例傳代至處于相同倍增水平的足夠建庫的細(xì)胞量（如均處于第N代），挑選出狀態(tài)良好的細(xì)胞，在同一次操作中，將這些細(xì)胞消化、離心收集，將細(xì)胞用凍存液重懸后合并在同一容器中，混合均勻，按照規(guī)定的量分裝到凍存管中，按照經(jīng)過驗(yàn)證的程序凍存后保存于液氮或其它超低溫設(shè)備中，這樣獲得的任何一支凍存管中的細(xì)胞均可代表這一批細(xì)胞。在建庫過程中，將雖然處于相同的倍增水平，但是在不同次操作中制備的凍存細(xì)胞不能作為同一個(gè)庫管理，如將處于同一倍增水平的細(xì)胞分別在兩個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)凍存，或在同一時(shí)間收集但分別在不同的容器中混勻后分裝、均不能作為同一個(gè)庫管理。

主庫和工作庫的代次、每一支的裝量以及保存的數(shù)量需要根據(jù)種子的特性、生產(chǎn)能力和生產(chǎn)穩(wěn)定性、預(yù)期的規(guī)模和預(yù)期的產(chǎn)品生命周期等因素綜合考慮，如在產(chǎn)品開發(fā)早期，可建立相對(duì)小的工作庫，以滿足產(chǎn)品藥學(xué)、臨床前及臨床研究的需要，而到了上市階段，甚至是從確證性臨床開始，則需要考慮產(chǎn)品的預(yù)期生命周期，生產(chǎn)規(guī)模以及每年的產(chǎn)能等，選擇建立一個(gè)相對(duì)大的工作庫更為合理。

種子庫的更換屬于生產(chǎn)變更的范圍，更換主庫通常會(huì)被認(rèn)定為較大的變更，特別是對(duì)于那些經(jīng)過基因修飾操作的細(xì)菌或細(xì)胞，如從原有的種子庫或主庫中重新挑選克隆建立新的主庫的操作即屬于風(fēng)險(xiǎn)較高的變更，需要進(jìn)行全面的評(píng)估。但工作庫可以根據(jù)年度使用情況，從主庫中重新制備新批次的工作庫，并按照規(guī)定的要求檢定合格后使用。

4 種子庫的質(zhì)量要求是什么？如何管理種子庫？

（1）菌種庫的質(zhì)量要求：菌種庫的質(zhì)量檢測(cè)主要包括：菌種鑒別及純度、活菌數(shù)、質(zhì)?；蛐蛄?、質(zhì)粒保有率及穩(wěn)定性等。菌種的鑒別及純度需采用不同的方法聯(lián)合檢測(cè)，包括通過培養(yǎng)，檢測(cè)其菌落的形態(tài)以及是否有雜菌生長(zhǎng)；將細(xì)菌染色，通過鏡檢法檢測(cè)其菌的形態(tài)及染色特性；通過生化反應(yīng)可檢測(cè)菌種的生化特性，這些方法可證明所用菌種是本菌，無其它菌的污染。通過檢測(cè)質(zhì)粒序列、拷貝數(shù)及限制性酶切圖譜證明菌種中的質(zhì)粒含有目的元件及相應(yīng)的拷貝數(shù)，通過檢測(cè)質(zhì)粒的保有率驗(yàn)證菌種的穩(wěn)定性并限定菌種使用的傳代水平。因輔助質(zhì)粒在真核中表達(dá)，因此，在菌種檢定時(shí)不必要檢查其插入基因表達(dá)的水平。除此，還應(yīng)對(duì)菌種進(jìn)行雜菌及噬菌體的污染檢查，以保證菌種的安全性。

近年來，隨著技術(shù)的發(fā)展及對(duì)藥品質(zhì)量要求的提高，為監(jiān)測(cè)菌種的穩(wěn)定性，開始增加生產(chǎn)用菌種全序列背景資料的要求，因此，研究者可根據(jù)研究的進(jìn)度逐步開展相關(guān)的研究工作。

（2）細(xì)胞庫的質(zhì)量要求：《中國(guó)藥典》三部生物制品通則《生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程》中規(guī)定了細(xì)胞基質(zhì)的質(zhì)量要求，包括細(xì)胞鑒別（種屬、株及專屬特性）、外源因子污染檢查（包括非病毒性及病毒性內(nèi)外源因子）、成瘤性及致瘤性檢測(cè)、染色體核型、均一性以及穩(wěn)定性等，但對(duì)于每種特定細(xì)胞來說，需設(shè)置更具體的檢測(cè)項(xiàng)目。

由于生產(chǎn)CAR-T細(xì)胞病毒載體的細(xì)胞主要有穩(wěn)轉(zhuǎn)的PG13-CAR細(xì)胞、HEK293、293T或 293T/17，它們是已知體內(nèi)具有成瘤性的細(xì)胞，293T細(xì)胞已有多種重組產(chǎn)品的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)，且 CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品主要用于目前尚無有效手段治療的腫瘤患者，而且病毒載體不直接進(jìn)入患者體內(nèi)，所以在細(xì)胞庫檢定中主要進(jìn)行細(xì)胞鑒別、外源因子污染檢查，可以不進(jìn)行其成瘤性及致瘤性檢測(cè)，但在轉(zhuǎn)染載體中要考慮細(xì)胞殘留成分的檢測(cè)，如宿主 DNA及細(xì)胞蛋白的檢測(cè)。但如果使用新的細(xì)胞時(shí)，作為細(xì)胞特性鑒別的特征之一，還是要考慮進(jìn)行成瘤性檢測(cè)。

對(duì)于穩(wěn)轉(zhuǎn)的PG13-CAR細(xì)胞，除種屬鑒別外，其鑒別試驗(yàn)中要包括特定插入基因的鑒別（如插入基因序列、拷貝數(shù)等），同時(shí)，由于其為鼠源細(xì)胞，所以在進(jìn)行細(xì)胞庫的充分評(píng)估時(shí)，特定外源病毒檢測(cè)項(xiàng)還要進(jìn)行鼠源病毒的檢測(cè)，而逆轉(zhuǎn)錄病毒的檢查則可以直接采用電鏡檢查其逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒以及感染試驗(yàn)進(jìn)行復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒RCR污染的檢測(cè)。另外，由于生產(chǎn)病毒載體的PG13-CAR是穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，還需要評(píng)估其傳代穩(wěn)定性，通過插入基因、病毒包裝及包裝病毒滴度等參數(shù)進(jìn)行細(xì)胞的穩(wěn)定性分析，以限定其包裝病毒所用的最高生產(chǎn)用代次。

對(duì)于慢病毒載體的包裝細(xì)胞，如HEK293、 293T或293T/17，可通過種屬、細(xì)胞株STR圖譜以及SV40大T抗原等進(jìn)行鑒別。如對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了新的基因修飾，則需增加修飾特征的鑒別。但需要注意的一點(diǎn)是，由于293類細(xì)胞屬于遺傳不穩(wěn)定細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行克隆篩選、無血清馴化、遺傳操作、甚至長(zhǎng)時(shí)間傳代時(shí)易造成STR圖譜的變化，如原有等位基因位點(diǎn)的重復(fù)數(shù)發(fā)生變化、在原STR圖譜數(shù)據(jù)上可能會(huì)有一個(gè)或兩個(gè)STR位點(diǎn)出現(xiàn)新的三等位基因峰等，因此，需通過系統(tǒng)分析細(xì)胞特性變化過程中的STR圖譜從而重新建立其特征性圖譜。但如果多個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)三等位基因峰時(shí)，則表明該細(xì)胞與其它人源細(xì)胞發(fā)生了交叉污染，不得用于病毒包裝。

（3）種子庫的管理：在《中國(guó)藥典》三部中明確規(guī)定了菌種庫及細(xì)胞庫的管理要求，包括細(xì)菌或細(xì)胞一旦從庫中移出，不得再回凍至庫內(nèi)；研究用菌種或細(xì)胞與生產(chǎn)用的菌種或細(xì)胞要嚴(yán)格分開存放；需建立臺(tái)賬、凍存容器的監(jiān)測(cè)及維護(hù)等。

5 如何考慮質(zhì)粒載體的生產(chǎn)工藝及規(guī)模？質(zhì)粒載體的質(zhì)量控制包括哪些？

制備質(zhì)粒載體時(shí)，從工作種子批取一支或幾支菌種復(fù)蘇，逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)后（培養(yǎng)過程中不應(yīng)再使用抗生素等具有篩選壓力的試劑）進(jìn)行質(zhì)粒提取，經(jīng)純化及除菌過濾后成為質(zhì)粒批。質(zhì)粒的純化工藝會(huì)隨著產(chǎn)品研發(fā)的進(jìn)展而不斷提高，如在研發(fā)早期或早期臨床時(shí)可能采用質(zhì)粒提取試劑等進(jìn)行質(zhì)粒載體的純化，但隨著臨床研究的進(jìn)展，制備慢病毒載體的質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)染T細(xì)胞的質(zhì)粒載體則需要考慮工業(yè)化的質(zhì)粒生產(chǎn)方式，包括連續(xù)發(fā)酵工藝、柱純化工藝等，并開展質(zhì)粒生產(chǎn)工藝驗(yàn)證研究，包括對(duì)雜質(zhì)清除能力的驗(yàn)證研究。對(duì)于用非病毒系統(tǒng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染載體來說，因直接用于T細(xì)胞轉(zhuǎn)染，還需要考慮質(zhì)粒的制劑配方工藝，如制劑緩沖液配方既要保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，又要減少對(duì)T細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)還需要盡可能符合產(chǎn)品制劑的要求。

生產(chǎn)質(zhì)粒菌種的傳代次數(shù)應(yīng)有菌種傳代穩(wěn)定性數(shù)據(jù)的支持，應(yīng)采用能保證從菌種庫工作種子批代次復(fù)蘇后傳代至質(zhì)粒載體生產(chǎn)所用的細(xì)菌代次盡可能少的生產(chǎn)工藝，且在CAR-T上市后，用于制備慢病毒載體的質(zhì)粒的菌種傳代次數(shù)應(yīng)不高于工藝驗(yàn)證的最大傳代次數(shù)；同時(shí)需要考慮每個(gè)質(zhì)粒的生產(chǎn)規(guī)模應(yīng)與慢病毒載體及CAR-T細(xì)胞預(yù)期規(guī)模相匹配，為了提高生產(chǎn)的一致性，單批次質(zhì)粒應(yīng)有足夠的量可以滿足制備多批次的慢病毒載體及CAR-T細(xì)胞。

質(zhì)粒的質(zhì)量控制通常需要考慮質(zhì)粒鑒別、含量、純度（包括DNA形式及雜質(zhì)）、無菌、內(nèi)毒素等，對(duì)于直接用于轉(zhuǎn)染T細(xì)胞的質(zhì)粒載體，還需要考慮質(zhì)粒的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。其中，質(zhì)粒鑒別檢查時(shí)，盡管在菌種庫質(zhì)量控制中進(jìn)行了質(zhì)粒的基因序列測(cè)定且進(jìn)行了菌種穩(wěn)定性的研究，但在質(zhì)粒質(zhì)控時(shí)仍需進(jìn)行質(zhì)粒序列測(cè)定或限制性酶切法對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行鑒別，確認(rèn)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)及序列的正確性。質(zhì)粒的純度控制包括兩個(gè)方面，一方面控制質(zhì)粒本身的質(zhì)量，如可采用OD260/OD280的比值、電泳法或液相法等，不僅可以控制質(zhì)粒所占的百分比，還可分析及監(jiān)測(cè)質(zhì)粒的不同形式，如超螺旋、解螺旋及線性的比例，不同質(zhì)粒狀態(tài)比例的控制主要是考慮對(duì)慢病毒包裝效率以及T細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響，并可作為質(zhì)粒批間一致性的控制；另一方面，純度的檢測(cè)還應(yīng)包括對(duì)工藝雜質(zhì)的控制，如宿主菌蛋白殘留、宿主菌DNA殘留以及工藝中添加的其它需要控制的成分。為控制質(zhì)量檢測(cè)的有效性，研究者應(yīng)在產(chǎn)品研發(fā)過程中建立質(zhì)粒參比品，用于質(zhì)粒鑒別、純度及細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)的控制。

質(zhì)粒保存的穩(wěn)定性研究也是質(zhì)粒質(zhì)量控制的一個(gè)重要參數(shù)，通過分析不同保存時(shí)間及不同保存溫度下質(zhì)粒的不同形式比例的變化、對(duì)T細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響確定質(zhì)粒使用的有效期。

6   病毒載體的生產(chǎn)規(guī)模要設(shè)計(jì)多大？是否可以采用細(xì)胞培養(yǎng)皿進(jìn)行病毒載體的培養(yǎng)？關(guān)鍵工藝研究包括哪些？病毒載體制備過程中如何降低牛血清的風(fēng)險(xiǎn)？

病毒載體規(guī)模的設(shè)計(jì)需要根據(jù)單次感染T細(xì)胞所需要的病毒量、質(zhì)量檢測(cè)所需要的量、留樣量、病毒載體的穩(wěn)定性以及預(yù)期的年度病毒用量等因素綜合考慮。在臨床試驗(yàn)過程中，一方面因在評(píng)估 CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的同時(shí)也要評(píng)估病毒載體工藝及其穩(wěn)健性，需要使用不止一個(gè)批次的病毒載體制備 CAR-T細(xì)胞；另一方面，由于T細(xì)胞供體的個(gè)體差異大，為減少病毒批次一致性不足造成的影響，又不應(yīng)使用過多批次的病毒載體，因此病毒生產(chǎn)規(guī)模的設(shè)計(jì)要同時(shí)兼顧這兩方面的需要。而對(duì)于上市后 CAR-T細(xì)胞的制備，在病毒載體保存穩(wěn)定性數(shù)據(jù)的支持下，采用大規(guī)模制備的病毒載體更有利于產(chǎn)品的安全性、有效性及一致性。

產(chǎn)品早期研究時(shí)，研究者可能會(huì)采用培養(yǎng)皿進(jìn)行病毒載體的制備，但對(duì)于生產(chǎn)臨床用病毒載體來說，這種培養(yǎng)方式引入污染的風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較大，因此，制備臨床用的病毒載體應(yīng)采用盡可能封閉的系統(tǒng)，如細(xì)胞工廠或生物反應(yīng)器。

對(duì)于γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，因可建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，如PG13細(xì)胞生產(chǎn)GALV病毒載體，在生產(chǎn)病毒載體時(shí)，從工作細(xì)胞庫中取出1支或多支凍存細(xì)胞復(fù)蘇，合并后接種于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)瓶，逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，收獲培養(yǎng)上清即可獲得γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體懸液。而制備慢病毒載體時(shí)，目前主要是采用三質(zhì)?；蛩馁|(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的方法，從WCB取一支或多支包裝細(xì)胞，擴(kuò)增至所需數(shù)量后，加入適當(dāng)比例的輔助質(zhì)粒載體及穿梭質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，培養(yǎng)一定時(shí)間后收獲上清，即獲得慢病毒載體懸液。

為獲得高滴度的病毒，應(yīng)開展病毒培養(yǎng)工藝的研究，包括不同階段細(xì)胞培養(yǎng)用液、輔助質(zhì)粒與穿梭質(zhì)粒的比例、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法及所用試劑（如磷酸鈣、PEI或其它轉(zhuǎn)染試劑如lipofect2000等）、轉(zhuǎn)染時(shí)間及效率、病毒收獲時(shí)間及收獲次數(shù)，病毒懸液保存條件等關(guān)鍵工藝參數(shù)，并進(jìn)行驗(yàn)證。因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的穩(wěn)定性相對(duì)較差，在4~8℃保存及反復(fù)凍融均會(huì)明顯降低病毒的感染滴度，所以，在工藝設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)考慮采用培養(yǎng)及純化的連續(xù)工藝，以減少中間品保存的時(shí)間，同時(shí)還應(yīng)考慮增大收獲病毒培養(yǎng)液的規(guī)模同時(shí)降低收獲次數(shù)的工藝，以提高病毒產(chǎn)量的同時(shí)保證病毒的滴度。

目前病毒載體制備中仍多采用含血清工藝，但為了降低牛血清的風(fēng)險(xiǎn)，一方面，在使用前按照藥典中新生牛血清的質(zhì)量要求進(jìn)行牛血清的檢測(cè)，在病毒載體的質(zhì)量控制中進(jìn)行牛血清白蛋白殘留量的檢測(cè)；另一方面，鼓勵(lì)開展病毒載體的低血清以及無血清生產(chǎn)工藝的研究，如在病毒包裝階段采用低血清培養(yǎng)或無動(dòng)物源性培養(yǎng)液替代牛血清的工藝研究。

7 是否要進(jìn)行病毒載體生產(chǎn)終末細(xì)胞的檢定？

是的，進(jìn)行病毒載體生產(chǎn)終末細(xì)胞的檢定，其目的在于評(píng)價(jià)病毒載體的生產(chǎn)工藝是否會(huì)引入外源病毒因子或激活內(nèi)源性病毒因子而增加產(chǎn)品的風(fēng)險(xiǎn)。因目前用于T細(xì)胞轉(zhuǎn)染的病毒載體主要分泌到培養(yǎng)上清中，包裝細(xì)胞病變相對(duì)較弱，因此，其生產(chǎn)終末細(xì)胞即是指病毒液收獲后的細(xì)胞。一般來說，在生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的情況下，至少要進(jìn)行一次生產(chǎn)終末細(xì)胞的全面檢定，檢測(cè)項(xiàng)目至少包括細(xì)胞鑒別、無菌檢查、支原體檢查及病毒污染檢查，其中病毒污染檢查中應(yīng)包括復(fù)制型病毒（RCR/RCL）的檢測(cè)，而細(xì)胞種屬特定病毒可不再重復(fù)檢測(cè)。但如果生產(chǎn)工藝發(fā)生了變化，則需要重新進(jìn)行生產(chǎn)終末細(xì)胞的檢測(cè)。

8 如何開展病毒載體中的外源因子污染的檢測(cè)？

對(duì)于轉(zhuǎn)染T細(xì)胞的病毒載體來說，外源因子污染是影響其安全性的一個(gè)重要風(fēng)險(xiǎn)因素，因此，應(yīng)對(duì)每批的病毒載體進(jìn)行外源因子污染的檢測(cè)，其檢測(cè)項(xiàng)目主要包括細(xì)菌、真菌污染、支原體污染及外源病毒因子污染，被測(cè)樣本應(yīng)不得檢出外源因子。

根據(jù)最適樣本的原則，取病毒載體的收獲液進(jìn)行外源因子污染的檢測(cè)能最大程度地反映污染的風(fēng)險(xiǎn)，如進(jìn)行多次病毒載體收獲，則每次收獲時(shí)均應(yīng)取收獲液檢測(cè)。外源因子污染的檢查方法可見《中國(guó)藥典》三部的無菌檢查法、支原體檢查法及外源病毒因子污染檢查法的通則。但考慮到病毒載體的不穩(wěn)定性及下游工藝的連續(xù)性，在此階段也可考慮采用快速檢測(cè)方法放行而進(jìn)入下游純化工藝，但應(yīng)同時(shí)采用藥典方法進(jìn)行檢查，如果藥典方法檢測(cè)結(jié)果顯示有外源因子污染，則使用了該收獲液制備的任何批次的病毒載體均不得用于T細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

除藥典方法外，同時(shí)鼓勵(lì)研究者開發(fā)更敏感、更快速的外源因子檢測(cè)方法，如高通量測(cè)序法，經(jīng)驗(yàn)證后可考慮作為外源病毒因子污染檢查的替代方法。

9 病毒載體是否要純化？純化及濃縮工藝應(yīng)考慮哪些因素？純化的病毒載體如何保存？

因CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的有效成分為活細(xì)胞，其產(chǎn)品為無菌制劑但不能采用終端滅菌工藝及除菌過濾工藝，在細(xì)胞培養(yǎng)、收獲及制劑階段雖然有換液以及離心洗滌過程，但純化工藝仍顯不足，且不能采用有效的病毒清除及滅活工藝，因此，為降低病毒載體對(duì)CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的安全性風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)考慮對(duì)病毒載體收獲液進(jìn)行純化、濃縮并制成無菌病毒載體。

因γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及慢病毒載體病毒顆粒相對(duì)較大，屬中等大小病毒，且有包膜，在培養(yǎng)、純化及濃縮過程中對(duì)剪切力相對(duì)敏感，易破壞對(duì)細(xì)胞的感染性，因此，在進(jìn)行純化及濃縮工藝設(shè)計(jì)時(shí)，不僅要考慮盡可能采用減小這些破壞因素的純化工藝，如控制流速、減小切向流壓力，而且還必須要考慮純化工藝對(duì)雜質(zhì)的去除效果以及純化規(guī)模放大的能力，如采用柱層析法進(jìn)行病毒載體的純化。

為避免反復(fù)凍融，純化后的病毒載體應(yīng)保存在適宜的制劑配方緩沖液中，按照單次使用量分裝后在最適條件下進(jìn)行保存，病毒載體的最適保存條件應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證。

逆轉(zhuǎn)錄/慢病毒載體的穩(wěn)定性是影響該領(lǐng)域發(fā)展的一個(gè)重要因素，如果逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以長(zhǎng)期穩(wěn)定保存，則給病毒載體大規(guī)模化生產(chǎn)提供了發(fā)展空間，同時(shí)也會(huì)提高CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的一致性以及大大降低CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的成本，提高患者的可及性。病毒載體的制劑配方緩沖液、病毒載體的保存狀態(tài)（如凍干）及保存條件均是保持病毒載體穩(wěn)定的重要因素，因此，在臨床試驗(yàn)過程中，鼓勵(lì)研究者繼續(xù)開展病毒載體制劑及保存工藝的研究，以提高病毒載體的穩(wěn)定性。

10 純化后的病毒載體的質(zhì)量控制檢測(cè)需要考慮哪些參數(shù)？

純化后的病毒載體質(zhì)量控制通常會(huì)參照以病毒載體為終產(chǎn)品的基因治療產(chǎn)品的要求，主要質(zhì)控項(xiàng)目包括外觀、可見異物、CAR鑒別、pH、純度、病毒物理滴度和/或轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度、無菌檢查、復(fù)制型病毒（RCR/RCL）、工藝相關(guān)雜質(zhì)（如宿主細(xì)胞蛋白及DNA殘留、質(zhì)粒DNA殘留、總DNA殘留、牛血清白蛋白殘留、核酸酶殘留等）及細(xì)菌內(nèi)毒素等。針對(duì)一個(gè)特定的病毒載體，需根據(jù)病毒載體及其生產(chǎn)工藝的特點(diǎn)建立特定的質(zhì)量控制檢測(cè)項(xiàng)目及要求。

同質(zhì)粒參比品一樣，在病毒載體的純度、CAR 鑒別、物理及細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度的檢測(cè)中需要建立相應(yīng)的病毒載體參比品，但是由于病毒載體穩(wěn)定性及制備規(guī)模的限制可能會(huì)制約病毒參比品的研制，特別是慢病毒載體，因此，鼓勵(lì)研究者在臨床試驗(yàn)期間在病毒穩(wěn)定性數(shù)據(jù)積累的基礎(chǔ)上盡可能開展病毒載體參比品的研究工作以滿足產(chǎn)品上市時(shí)的需要。

11 采用何種方法進(jìn)行病毒載體的滴度測(cè)定？是否需要規(guī)定病毒載體的比活性？

不論是γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體還是慢病毒載體，因其均不具有復(fù)制能力，因此，不能通過常規(guī)的細(xì)胞病變法（如PFU或CCID50法）進(jìn)行病毒滴度的測(cè)定，而通常采用對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力做為病毒載體的滴度，即將病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)敏感細(xì)胞系（如293T 細(xì)胞、HT-1080細(xì)胞等）或原代細(xì)胞（如PBMC）后，檢測(cè)細(xì)胞CAR表達(dá)陽性率或CAR基因拷貝數(shù)，計(jì)算其轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度（TU/ml）。但由于不同的細(xì)胞對(duì)病毒載體的敏感性不同，不同的檢測(cè)參數(shù)對(duì)病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度結(jié)果也不同，因此，選擇何種細(xì)胞、檢測(cè)何種指標(biāo)進(jìn)行病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度的測(cè)定需要進(jìn)行充分的驗(yàn)證，同時(shí)，鼓勵(lì)研究者在臨床試驗(yàn)過程，探索病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度測(cè)定結(jié)果與轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞所用的病毒量、CAR-T細(xì)胞陽性率以及臨床有效性之間的關(guān)系，以建立最適病毒滴度測(cè)定方法及病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)劑量。

除病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度外，還可通過檢測(cè)病毒載體特定抗原或病毒基因拷貝數(shù)來檢測(cè)病毒載體的物理滴度，如慢病毒載體p24抗原含量的檢測(cè)。但由于病毒載體包裝過程中可能會(huì)形成無轉(zhuǎn)導(dǎo)效力的病毒，而這些無效力的病毒載體不能將CAR基因整合到T細(xì)胞基因組中，因而也不能產(chǎn)生CAR-T細(xì)胞，因此，為限制無轉(zhuǎn)導(dǎo)效力的病毒載體的水平以監(jiān)測(cè)病毒載體工藝的一致性，建議限定轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度與物理滴度的比例，即比活性。

12 采用何種方法進(jìn)行RCR/RCL檢測(cè)？

復(fù)制型病毒（RCR/RCL）是γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體與慢病毒載體的一個(gè)安全性質(zhì)量控制項(xiàng)目，因病毒載體設(shè)計(jì)的不同，產(chǎn)生復(fù)制型病毒的風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)有不同，如采用四質(zhì)粒共轉(zhuǎn)體系以及含有末端自我失活（Self Inactivating，SIN）結(jié)構(gòu)的病毒載體，其病毒載體生產(chǎn)過程中產(chǎn)生RCL的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)明顯降低，但盡管如此，產(chǎn)生RCR/RCL的風(fēng)險(xiǎn)仍不能完全排除，因此仍需要對(duì)病毒載體進(jìn)行RCR/RCL的檢測(cè)，且病毒載體不得檢出RCR/RCL。

復(fù)制型病毒的產(chǎn)生與病毒載體特點(diǎn)及載體設(shè)計(jì)有關(guān)，是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體生產(chǎn)體系中可能存在的風(fēng)險(xiǎn)，不是因外源而引入的風(fēng)險(xiǎn)，因此，取病毒載體收獲液或純化后的病毒載體用于RCR/RCL 檢測(cè)均具有一定的合理性，但這兩個(gè)點(diǎn)檢測(cè)各有利弊。如以病毒載體收獲液作為樣本，可以直接地反映病毒載體在包裝過程中出現(xiàn)RCR/RCL的風(fēng)險(xiǎn)，為達(dá)到有效的檢出，可能需要取較大的樣本量進(jìn)行檢測(cè)；如以純化后的病毒載體為檢測(cè)樣本，因病毒載體在經(jīng)過純化及濃縮工藝后，RCR/RCL同樣也會(huì)得到濃縮，檢測(cè)時(shí)可能需要取相對(duì)小的樣本量即可進(jìn)行有效的控制，也可直接反映出轉(zhuǎn)導(dǎo)的病毒載體中是否含有RCR/RLC，但也存在純化工藝可能會(huì)對(duì)原本含量可能很低的RCR/RCL造成破壞從而影響檢出的風(fēng)險(xiǎn)。不論選擇何種樣本，均需要對(duì)病毒載體進(jìn)行充分的復(fù)制型病毒的檢測(cè)，以降低在CAR-T階段產(chǎn)生RCR/RCL的風(fēng)險(xiǎn)。

目前RCR/RCL的檢測(cè)方法主要包括針對(duì)特定基因（如VSVG基因）的PCR法或QPCR法和敏感細(xì)胞感染試驗(yàn)法，即將待測(cè)樣本接種于敏感細(xì)胞上，進(jìn)行多次傳代，如樣本中有復(fù)制型病毒，在培養(yǎng)末期的時(shí)候通過觀察病變、p24抗原表達(dá)、RCR/RCL 特定基因表達(dá)或逆轉(zhuǎn)錄酶活性等可能反應(yīng)出病毒復(fù)制的情況，如用C8166細(xì)胞或其他敏感細(xì)胞檢測(cè)慢病毒載體的RCL。

RCR/RCL檢測(cè)方法要求具有較高的靈敏度，建立及驗(yàn)證RCR/RCL檢測(cè)方法時(shí)，可以考慮以復(fù)制型病毒或復(fù)制型病毒載體作為樣本驗(yàn)證方法的最低檢出水平。對(duì)于γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體GALV來說，因GALV為生物安全I(xiàn)I級(jí)，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室可以在 P2生物安全實(shí)驗(yàn)室開展RCR檢測(cè)方法的建立及驗(yàn)證以及樣本的檢測(cè)。對(duì)于復(fù)制型慢病毒（RCL）的檢測(cè)來說，可以采用HIV弱毒株或重組的條件復(fù)制型慢病毒載體作為陽性對(duì)照病毒。若以HIV弱毒株為陽性對(duì)照病毒，其感染試驗(yàn)所涉及的培養(yǎng)應(yīng)在P3 級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行；但若采用條件復(fù)制型的慢病毒載體作為陽性對(duì)照，則可以在生物安全級(jí)別至少為P2的實(shí)驗(yàn)室開展實(shí)驗(yàn)。其他非HIV骨架的慢病毒載體，可以在P2生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行陽性對(duì)照病毒培養(yǎng)并開展方法學(xué)研究和樣本檢測(cè)。

通常來講，應(yīng)對(duì)每批制備的病毒載體進(jìn)行充分的RCR/RCL檢測(cè)，包括高靈敏的PCR法及敏感細(xì)胞感染試驗(yàn)法，但結(jié)合現(xiàn)有慢病毒載體臨床試驗(yàn)的安全性數(shù)據(jù)、P3實(shí)驗(yàn)室做為常規(guī)檢測(cè)的低操作可行性和復(fù)制型慢病毒載體制備的困難，在CAR-T 細(xì)胞產(chǎn)品臨床試驗(yàn)早期，可考慮用靈敏的PCR法進(jìn)行RCR/RCL的控制檢測(cè)，但在確證性臨床階段以及上市前則必須采用敏感細(xì)胞感染試驗(yàn)監(jiān)測(cè)病毒載體中的RCR/RCL的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

13 如何考慮病毒載體工藝雜質(zhì)質(zhì)量控制的要求？

病毒載體工藝雜質(zhì)殘留量的限定標(biāo)準(zhǔn)可以參考in-vivo方式的病毒基因治療制劑的要求，但同時(shí)也需要考慮，因用于T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的病毒載體并不直接進(jìn)入人體，且在細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)后，CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)的過程中會(huì)經(jīng)過多次培養(yǎng)液的更換以及細(xì)胞收獲后洗滌過程，這些操作均會(huì)不同程度的降低工藝雜質(zhì)的含量，因此，對(duì)于那些工藝雜質(zhì)殘留量質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定還應(yīng)結(jié)合下游工藝驗(yàn)證的數(shù)據(jù)綜合評(píng)估后再確定標(biāo)準(zhǔn)。但是對(duì)于牛血清白蛋白殘留量來說，因其是一個(gè)明顯的過敏原，且會(huì)吸附在細(xì)胞表面不易去除，因此，仍應(yīng)建立嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，可考慮以單次轉(zhuǎn)導(dǎo)所用的病毒量為一個(gè)劑量，應(yīng)不高于50ng/劑。

14 是否要開展病毒載體的穩(wěn)定性研究以及如何設(shè)定穩(wěn)定性評(píng)價(jià)參數(shù)？

是的，病毒載體的穩(wěn)定性研究數(shù)據(jù)是制定病毒載體保存條件及有效期的重要依據(jù)，因病毒載體的生產(chǎn)成本較高，在研究早期，可重點(diǎn)開展保存溫度及轉(zhuǎn)導(dǎo)條件的病毒載體穩(wěn)定性研究，保存溫度應(yīng)開展實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究，而轉(zhuǎn)導(dǎo)條件的穩(wěn)定性可根據(jù)轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞的最長(zhǎng)時(shí)間設(shè)置穩(wěn)定性研究的時(shí)間點(diǎn)，穩(wěn)定性研究主要考查病毒載體對(duì)保存條件敏感的質(zhì)量參數(shù)，如可見異物、轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度、無菌及細(xì)菌內(nèi)毒素等，如是凍干保存的病毒載體，還需進(jìn)行水分的檢測(cè)。

15 轉(zhuǎn)導(dǎo)載體是否允許外包加工？如何控制外包加工的轉(zhuǎn)導(dǎo)載體的質(zhì)量？

由于病毒載體制備，特別是臨床級(jí)的慢病毒載體制備，是一個(gè)復(fù)雜及專業(yè)化程度很高的過程，對(duì)生產(chǎn)設(shè)施、設(shè)備、工藝驗(yàn)證等等都需要高額的投入，因此，國(guó)際上一些開展CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品開發(fā)的公司會(huì)選擇與病毒載體制備機(jī)構(gòu)合作的方式，為其提供病毒載體，這種方式也有可能成為未來我國(guó)CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的生產(chǎn)模式，因此，如果擬采用外包的方式制備病毒載體，那么CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)單位應(yīng)對(duì)自己所用的質(zhì)粒載體及病毒載體進(jìn)行充分的驗(yàn)證，建立基礎(chǔ)的生產(chǎn)及純化工藝，并制定病毒載體的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)后，再選用有GMP 資質(zhì)的病毒載體公司進(jìn)行生產(chǎn)。CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)單位既應(yīng)保證生產(chǎn)病毒載體的公司其質(zhì)量體系符合 GMP的要求，又要保證病毒載體生產(chǎn)全過程符合該 CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)單位所制定的該病毒載體特定的質(zhì)量要求，包括對(duì)原材料、菌種庫及細(xì)胞庫、質(zhì)粒生產(chǎn)及病毒生產(chǎn)的要求，并與病毒載體公司間建立嚴(yán)格的供應(yīng)商審計(jì)制度、產(chǎn)品質(zhì)控及年度報(bào)告等質(zhì)量協(xié)議要求，以保證可獲得質(zhì)量穩(wěn)定的病毒載體。同時(shí)，CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)單位必須根據(jù)所制定的病毒載體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)每批病毒載體的關(guān)鍵質(zhì)量控制參數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，合格后方能放行使用。

五   建立可提供T細(xì)胞的供體資質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)

1 選擇T細(xì)胞供體的基本考慮是什么？

同其他免疫細(xì)胞產(chǎn)品一樣，CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的生產(chǎn)也是從供體細(xì)胞采集開始進(jìn)入制備流程的，這是免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品一個(gè)非常典型的特征，也是造成最終細(xì)胞產(chǎn)品一致性較差的一個(gè)重要原因，因此，需建立準(zhǔn)確、合理的供體標(biāo)準(zhǔn)。而且，對(duì)于 CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品來說，盡管研究者在不斷地開展提高其安全性的研究，但到目前為止，其臨床使用的風(fēng)險(xiǎn)尚不能充分評(píng)估，因此，使用人群仍限制在無有效治療手段的腫瘤晚期患者，而這種患者因其前期的治療過程更為復(fù)雜，個(gè)體狀況的差異性更大，因此，更需要建立供體與CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品之間的相關(guān)性，提高CAR-T細(xì)胞制備的成功率及質(zhì)量可控性。

建立供體標(biāo)準(zhǔn)至少要考慮：（1）對(duì)供體身體狀況的基本要求，如血常規(guī)指標(biāo)、外周血淋巴細(xì)胞數(shù)或某種特定表型細(xì)胞的數(shù)量等；（2）臨床適應(yīng)癥：如腫瘤類別及分期、腫瘤負(fù)荷、采集初始樣本前與現(xiàn)在治療方案的間隔、血液腫瘤患者外周血中腫瘤細(xì)胞表型及數(shù)量等；（3）傳染性疾病因子的篩查和檢測(cè)：對(duì)傳染性疾病因子的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)需結(jié)合 CAR-T細(xì)胞的臨床治療目的來建立，如用于治療 HBV引起的肝癌的或治療HIV患者的自體CAR-T細(xì)胞，其供體的HBV或HIV-1/2的標(biāo)準(zhǔn)則可以其病毒載量值作為限定標(biāo)準(zhǔn)；（4）遺傳性疾病及腫瘤史篩查：主要用于異體供體的篩查。

2 細(xì)胞供體（者）應(yīng)進(jìn)行哪些傳染性疾病因子的檢測(cè)？應(yīng)采用何種方法檢測(cè)？

制備CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品所用的采集物為白細(xì)胞富集樣本，病原體篩查和檢測(cè)的種類至少應(yīng)包括HIV-1/2、HBV（表面抗原及核心抗原）、 HCV、梅毒、 CMV、EBV及HTLV-1/2。因CMV抗體陽性率較高，研究者需要建立CMV抗體陽性樣本是否使用或如何放行的操作細(xì)則。在細(xì)胞采集前，可取供體外周血樣本進(jìn)行抗體或抗原的檢測(cè)，檢測(cè)方法應(yīng)采用最靈敏的方法，如血源篩查試劑。病原體檢測(cè)時(shí)間與細(xì)胞采集時(shí)間間隔應(yīng)盡可能短。

對(duì)于異體細(xì)胞供體，必須進(jìn)行上述病原體的篩查及檢測(cè)，包括使用核酸檢測(cè)方法進(jìn)行病原體檢測(cè)，病原體陰性的才可作為細(xì)胞供體。

3 自體細(xì)胞供體是否必須要進(jìn)行傳染性疾病因子篩查和檢測(cè)？

對(duì)于自體細(xì)胞供者來說，因其僅限于自體使用，其病原體傳播的風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較小，且腫瘤患者入院時(shí)已經(jīng)進(jìn)行了一定程度的病原體檢測(cè)，因此，對(duì)于自體供體的病原體篩查和檢測(cè)是建議性而非強(qiáng)制性的，其目的是了解供者病原體感染狀況，如果供體某種病原體檢測(cè)為陽性，或未進(jìn)行篩查，在后期細(xì)胞操作時(shí)需要考慮細(xì)胞培養(yǎng)方法是否會(huì)造成病毒或其它外源因子的增殖或傳播，從而危及到操作者或?qū)ζ渌┱邩颖驹斐山徊娓腥?，并采取相?yīng)的防護(hù)或隔離操作措施。

4 如使用可建系的細(xì)胞制備CAR- T細(xì)胞，如何評(píng)估其供體及細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)？

對(duì)細(xì)胞供體應(yīng)進(jìn)行遺傳性疾病及腫瘤基因的篩查和檢測(cè)，細(xì)胞系則需要按照《中國(guó)藥典》三部生物制品通則《生物制品生產(chǎn)及檢定用細(xì)胞的制備及檢定規(guī)程》的要求建立細(xì)胞庫，并進(jìn)行全面的質(zhì)量評(píng)價(jià)，包括細(xì)胞鑒別、外源因子污染（包括非病毒性及病毒性內(nèi)外源因子）、細(xì)胞核型、成瘤性、穩(wěn)定性、免疫反應(yīng)性等。

5 在臨床試驗(yàn)過程中如何進(jìn)一步開展供體資質(zhì)的研究？

對(duì)于自體細(xì)胞供者來說，因CAR-T的治療效果與安全性與自體患者密切相關(guān)，在臨床試驗(yàn)過程中應(yīng)更進(jìn)一步開展自體患者前期治療手段及治療階段、腫瘤的異質(zhì)性（如外周血中不同表型的血液腫瘤細(xì)胞）、特定腫瘤標(biāo)記、外周血單核細(xì)胞采集時(shí)間、細(xì)胞中各表型細(xì)胞組成的比例或某種特定成份與CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增的成功率、體外生物學(xué)效力、治療效果及不良反應(yīng)間的關(guān)系，以便獲得更精準(zhǔn)的數(shù)據(jù)用以嚴(yán)格限定自體或異體供者的入選條件，使最合適的患者最大獲益。

對(duì)于異體供者來說，在臨床試驗(yàn)中還應(yīng)更多地開展供體與患者HLA表型相合度以及治療方案與免疫排斥之間的相關(guān)性研究。

六   C AR - T細(xì)胞產(chǎn)品的生產(chǎn)、質(zhì)量控制研究及檢測(cè)

1   CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝研究應(yīng)考慮哪些因素？

CAR-T 細(xì)胞制備可大致劃分為以下幾個(gè)工藝步驟：外周血細(xì)胞采集及單核細(xì)胞的分離（或凍存）、T細(xì)胞分選、T 細(xì)胞活化、T 細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)（或轉(zhuǎn)染）、CAR-T 細(xì)胞擴(kuò)增和收集洗滌及制劑。每一個(gè)步驟均應(yīng)開展工藝研究，包括外周血細(xì)胞的采集量、單核細(xì)胞分離試劑的選擇及分離方法， PBMC的凍存條件及凍存時(shí)間、T細(xì)胞分選試劑和活化試劑的選擇及用量?jī)?yōu)化、培養(yǎng)液的選擇及優(yōu)化、添加因子及使用濃度的優(yōu)化、培養(yǎng)方式的選擇及優(yōu)化、細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)方法及載體用量的選擇和優(yōu)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)染條件及轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)染時(shí)間的優(yōu)化、CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增條件的優(yōu)化、細(xì)胞收獲方法及洗滌條件、 CAR-T細(xì)胞制劑配方的優(yōu)化、細(xì)胞凍存方法的優(yōu)化、CAR-T細(xì)胞運(yùn)輸條件及復(fù)蘇條件的優(yōu)化等，并進(jìn)行部分工藝及完整工藝的充分驗(yàn)證，確定最終的工藝參數(shù)，如PBMC有分離后使用和凍存后再使用兩種工藝，驗(yàn)證時(shí)則需要對(duì)這兩種工藝均進(jìn)行工藝驗(yàn)證。

對(duì)于已知病原體陽性的自體CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品工藝或用異體T細(xì)胞制備CAR-T的工藝還要驗(yàn)證T 細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增體系不會(huì)造成傳染性疾病因子的培養(yǎng)及擴(kuò)增。另外，與自體CAR-T細(xì)胞相比，異體 CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品因其可用于多個(gè)患者，其傳染性疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)較高，因此，對(duì)于異體CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品不鼓勵(lì)使用新鮮制備的細(xì)胞劑型。

因多種因素的限制，自體CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品可能在應(yīng)用于患者前未必能夠進(jìn)行全部項(xiàng)目的檢定，所以工藝驗(yàn)證尤為重要。但工藝研究及驗(yàn)證必須結(jié)合工藝的實(shí)際情況設(shè)定相應(yīng)的驗(yàn)證參數(shù)，如人工操作、模塊式制備系統(tǒng)、全封閉自動(dòng)制備系統(tǒng)等，可能需要研究以及驗(yàn)證的工藝步驟不同，因此，也需要設(shè)置不同的工藝驗(yàn)證參數(shù)。

由于CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品工藝研究在不斷進(jìn)展，到目前為止，業(yè)界對(duì)何種工藝最好并未達(dá)成共識(shí)，因此，可以在產(chǎn)品研發(fā)過程及早期臨床試驗(yàn)階段開展不同程度的工藝驗(yàn)證研究，但在確證性臨床試驗(yàn)過程中應(yīng)完成充分的工藝驗(yàn)證。

工藝驗(yàn)證完成后，應(yīng)在關(guān)鍵工藝步驟設(shè)置關(guān)鍵過程控制參數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)，以提高CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的生產(chǎn)一致性。

2 如何定義CAR- T細(xì)胞的批次及批量？

從單一個(gè)體的PBMC細(xì)胞進(jìn)入分選開始至制備出可供臨床用CAR-T細(xì)胞為止，經(jīng)過這一單次工藝過程中所制備的CAR-T細(xì)胞稱為一個(gè)批次，此單一批次所制備出來的所有分裝的規(guī)格為此次生產(chǎn)的批量。如從自體供體中采集并分離PBMC后凍存保存，將凍存的一支或幾支PBMC復(fù)蘇，然后經(jīng)過分選、活化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、擴(kuò)增、收集及制劑過程后獲得 3~4個(gè)包裝的CAR-T細(xì)胞，這些細(xì)胞即稱為一個(gè)批次。如果再次從PBMC復(fù)蘇制備CAR-T細(xì)胞，則為另一個(gè)批次。對(duì)于自體供體來說，每一個(gè)批次的量一般較少，如每批可能有幾個(gè)包裝規(guī)格；而對(duì)于異體供者來說，CAR-T細(xì)胞的批次可能會(huì)有50~100 個(gè)包裝規(guī)格。

3 CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的質(zhì)量控制研究及檢測(cè)至少應(yīng)包括哪些項(xiàng)目？應(yīng)如何設(shè)置這些質(zhì)控項(xiàng)目更符合CAR- T細(xì)胞產(chǎn)品的特點(diǎn)？

CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品的質(zhì)量控制研究及檢測(cè)項(xiàng)目一般應(yīng)包括：細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞活率、細(xì)胞表型、CAR陽性率檢測(cè)、生物學(xué)效力檢測(cè)，無菌檢查、支原體、熱原/內(nèi)毒素的檢測(cè)、CAR-T細(xì)胞基因組中病毒載體拷貝數(shù)及整合的檢測(cè)、RCR/RCL 檢測(cè)、工藝殘留物檢測(cè)（如具有潛在風(fēng)險(xiǎn)的磁珠殘留、細(xì)胞因子殘留、Retronectin殘留等）及腫瘤細(xì)胞殘留檢測(cè)。對(duì)于異體CAR-T細(xì)胞，還應(yīng)進(jìn)行組織相容性抗原檢測(cè)及采用核酸法進(jìn)行特定人源病毒的檢測(cè)。

對(duì)于異體供體（非直系親屬或移植配型個(gè)體）的CAR-T細(xì)胞，因可成為貨架期產(chǎn)品，批量相對(duì)較大，因此，除取收獲的細(xì)胞懸液為最適檢測(cè)樣本用于支原體的檢測(cè)外，所有其它的檢測(cè)項(xiàng)目均可在最終的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品中檢測(cè)，所有檢測(cè)結(jié)果均合格后方可放行。

而對(duì)于自體CAR-T細(xì)胞，原則上應(yīng)盡可能用最終細(xì)胞產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，但考慮到因單次制備的批量有限，即使凍存劑型的CAR-T細(xì)胞為配合患者的治療時(shí)間，有的可能難以完成所有的檢測(cè)，因此，需要在用最小的樣本量達(dá)到最大程度地控制產(chǎn)品質(zhì)量控制之間進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，即采用在制備過程中不同的點(diǎn)取樣以及CAR-T細(xì)胞最終制劑取樣進(jìn)行上述的項(xiàng)目檢測(cè)的策略，取樣點(diǎn)的設(shè)定需要根據(jù)工藝特點(diǎn)及工藝驗(yàn)證的結(jié)果確定。如：無菌檢查、細(xì)菌內(nèi)毒素則應(yīng)取最終包裝的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)；無菌檢查也可取CAR-T細(xì)胞收獲前的樣本進(jìn)行快速方法的補(bǔ)充檢測(cè)。再如CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的劑量通常是以活的CAR陽性的T細(xì)胞數(shù)來標(biāo)示，在分裝前需要根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果、細(xì)胞活率、 T細(xì)胞陽性率以及CAR陽性率來計(jì)算分裝量，并需要在分裝時(shí)將標(biāo)簽貼在凍存袋上，因此，細(xì)胞表型及CAR陽性率檢測(cè)可能需要在細(xì)胞收獲前進(jìn)行，而細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞存活率則需要在分裝前檢測(cè)，如為凍存細(xì)胞，還需要通過凍存工藝驗(yàn)證研究證明凍存后的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品仍可以符合患者劑量的要求，并結(jié)合凍存工藝驗(yàn)證的結(jié)果制定終產(chǎn)品相應(yīng)項(xiàng)目的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。其它檢測(cè)項(xiàng)，如CAR-T細(xì)胞基因組病毒載體拷貝數(shù)及整合位點(diǎn)的檢測(cè)可在收獲前取 CAR-T細(xì)胞懸液進(jìn)行檢測(cè)；RCR/RCL和工藝殘留物檢測(cè)則可在凍存前取樣檢測(cè)；而生物學(xué)效力在分裝前取樣還是取最終包裝的細(xì)胞懸液進(jìn)行檢測(cè)，可能需要根據(jù)方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果確定，如果方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示，分裝前取樣檢測(cè)與最終包裝取樣檢測(cè)的結(jié)果具有一致性，可將此項(xiàng)檢測(cè)前置。

針對(duì)一個(gè)特定的CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品，應(yīng)根據(jù)CAR-T的設(shè)計(jì)、基因修飾方法、所用的關(guān)鍵原材料、生產(chǎn)工藝及工藝驗(yàn)證數(shù)據(jù)、保存條件及預(yù)期用途等具體特點(diǎn)綜合考慮，設(shè)置個(gè)性化的質(zhì)量控制要求，包括過程控制及最終產(chǎn)品放行檢測(cè)的項(xiàng)目及標(biāo)準(zhǔn)，并在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中明確特定項(xiàng)目的取樣點(diǎn)及取樣要求。

4   選擇或建立質(zhì)量控制檢測(cè)方法時(shí)應(yīng)考慮哪些因素？ 如何制定其每一檢測(cè)項(xiàng)目的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)？

（1）細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞存活率：對(duì)于CAR-T細(xì)胞來說，患者輸入的細(xì)胞數(shù)及活率不僅與臨床有效性及臨床副反應(yīng)密切相關(guān)，而且是設(shè)置CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品包裝規(guī)格及臨床劑量的重要參數(shù)，因此，需要建立準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)及活率檢測(cè)方法，并建立產(chǎn)品的放行標(biāo)準(zhǔn)。

目前有多種方法用于CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品的細(xì)胞計(jì)數(shù)，包括傳統(tǒng)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法及細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)法，其中自動(dòng)計(jì)數(shù)儀又包括不同的計(jì)數(shù)原理，如利用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)、熒光染色法計(jì)數(shù)及非染色法計(jì)數(shù)等。與人工計(jì)數(shù)法相比，自動(dòng)計(jì)數(shù)儀節(jié)省人工，且明顯減少不同操作者之間的誤差，對(duì)于產(chǎn)品質(zhì)控檢測(cè)來說，自動(dòng)計(jì)數(shù)儀檢測(cè)結(jié)果的可重復(fù)性更好。不同自動(dòng)計(jì)數(shù)儀因每種方法計(jì)數(shù)原理不同，同一樣本在不同的計(jì)數(shù)儀上的結(jié)果會(huì)有明顯的差異，這些差異可能來自于染料的特性及其標(biāo)記特性、區(qū)分細(xì)胞不同活力狀態(tài)（如活細(xì)胞、死亡、凋亡細(xì)胞）的能力及計(jì)數(shù)軟件的設(shè)計(jì)等，因此，應(yīng)在計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證的基礎(chǔ)上建立細(xì)胞數(shù)及活率標(biāo)準(zhǔn)，且細(xì)胞數(shù)應(yīng)設(shè)立上限及下限標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞使用前活率應(yīng)不低于70%，但同時(shí)鼓勵(lì)研究者開發(fā)符合臨床使用要求的、可提高或維持凍存細(xì)胞復(fù)蘇后高活率的細(xì)胞凍存液。

（2）鑒別、均一性及純度檢測(cè)：因CAR-T細(xì)胞為以T細(xì)胞為主的異質(zhì)性細(xì)胞群，因此應(yīng)開展目的T細(xì)胞和非T細(xì)胞表型及含量質(zhì)量控制研究，并建立相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。鑒別及純度檢測(cè)目前主要采用流式細(xì)胞法，對(duì)不同的細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)。所采用的細(xì)胞表面標(biāo)記至少要包括兩類，一類表面標(biāo)記應(yīng)用于檢測(cè)CAR-T細(xì)胞中的非目標(biāo)細(xì)胞成份并限定其比例，包括NK細(xì)胞、單核細(xì)胞等。另一類表面標(biāo)記用于鑒別CAR-T細(xì)胞中目標(biāo)T細(xì)胞的比例及不同T細(xì)胞表型的組成，在前期研究中可能主要以CD3表型為主，但由于CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的持久性及有效性機(jī)制尚未完全闡明，因此，在臨床試驗(yàn)過程中研究者需要進(jìn)一步分析不同T細(xì)胞表型的比例與臨床有效性之間的相關(guān)性，如包括CD4 與CD8的比例、中央記憶T細(xì)胞、效應(yīng)記憶T細(xì)胞、效應(yīng)T細(xì)胞以及耗竭T細(xì)胞等對(duì)體內(nèi)效力及持久性的影響，為最終建立T細(xì)胞表型標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)，同時(shí)也為采用表型作為生物學(xué)效力替代檢測(cè)提供依據(jù)。

除細(xì)胞表型鑒別外，還應(yīng)關(guān)注細(xì)胞培養(yǎng)過程中出現(xiàn)交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，因此，在制備過程中不僅要通過標(biāo)識(shí)系統(tǒng)確保不同個(gè)體細(xì)胞的可溯源性，還應(yīng)通過工藝設(shè)計(jì)及有效的隔離措施防止出現(xiàn)交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)建議留取采集細(xì)胞樣本及CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品，如果出現(xiàn)意外情況時(shí)可用于個(gè)體來源檢測(cè)的原因分析。

（3）CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)/或轉(zhuǎn)染陽性率檢測(cè)：對(duì)于CAR-T細(xì)胞來說，發(fā)揮腫瘤殺傷作用的有效成份是CAR陽性的T細(xì)胞，CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的包裝規(guī)格及臨床使用劑量是以CAR-T陽性細(xì)胞數(shù)標(biāo)示的，因此，必須檢測(cè)CAR轉(zhuǎn)染陽性率。應(yīng)采用流式細(xì)胞法檢測(cè)CAR轉(zhuǎn)染陽性率，目前有針對(duì)CAR不同結(jié)構(gòu)區(qū)域的檢測(cè)方法，包括針對(duì)CAR抗原結(jié)合位點(diǎn)的，如CD19抗原或抗ScFv抗體，或針對(duì)輕鏈或鉸鏈區(qū)的抗Fab或Protein L，與其它兩種方法相比，針對(duì)抗原結(jié)合部位的CAR陽性率檢測(cè)方法具有更好的專屬性。因現(xiàn)有數(shù)據(jù)顯示不同程度的CAR陽性率（20%~80%）在臨床上均表現(xiàn)出了一定的有效性，建立統(tǒng)一的CAR陽性率的最低標(biāo)準(zhǔn)尚需更多的數(shù)據(jù)支持，但作為CAR-T細(xì)胞有效成份質(zhì)量控制的指標(biāo)，研發(fā)者需在申請(qǐng)臨床試驗(yàn)前建立特定產(chǎn)品的CAR陽性率最低標(biāo)準(zhǔn)，在臨床過程中進(jìn)一步開展生產(chǎn)工藝及檢測(cè)方法的研究及驗(yàn)證，結(jié)合早期的臨床數(shù)據(jù)，在確證性臨床前建立更合理的CAR陽性率標(biāo)準(zhǔn)。

（4）CAR-T細(xì)胞的生物學(xué)效力檢測(cè)：同其他生物制品相似，CAR-T細(xì)胞的生物學(xué)效力檢測(cè)方法最好可以模擬產(chǎn)品的作用機(jī)制（MOA），可以是體外法也可以是體內(nèi)法，并且鼓勵(lì)研究者開發(fā)定量的效力檢測(cè)方法。目前CAR-T的效力檢測(cè)有多種方法，如將CAR-T細(xì)胞與腫瘤靶細(xì)胞體外共同孵育后通過檢測(cè)腫瘤殺傷率或增殖抑制率、 IFN-γ的表達(dá)量、CAR-T細(xì)胞上某種與殺傷相關(guān)的細(xì)胞表型的變化等體外效力檢測(cè)方法，或采用動(dòng)物活體成像技術(shù)，檢測(cè)標(biāo)記的靶細(xì)胞腫瘤模型在體內(nèi)的減少或動(dòng)物生存期延長(zhǎng)等體內(nèi)效力檢測(cè)方法。在研發(fā)早期，研究者可能會(huì)采用體外細(xì)胞因子表達(dá)的替代指標(biāo)進(jìn)行效力檢測(cè)。但不論采用何種方法，在早期的方法學(xué)驗(yàn)證時(shí)，至少要分析方法的專屬性，證明其生物學(xué)效力與CAR-T細(xì)胞具有一定的量效關(guān)系，并考慮采用體內(nèi)法驗(yàn)證體外法的有效性。隨著研究及臨床試驗(yàn)的不斷深入，需要逐步建立起體外效力的有效評(píng)價(jià)方法及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并開展效力參比品的研究。

（5）無菌檢查：在可行的情況下，首選藥典方法用于無菌檢查，但考慮到CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的特殊性，也鼓勵(lì)研究者開發(fā)快速的無菌檢查法作為中間過程監(jiān)測(cè)或放行檢測(cè)方法，且在臨床試驗(yàn)過程中須按照中國(guó)藥典要求以及其它國(guó)際要求對(duì)快速無菌法進(jìn)行充分驗(yàn)證，且在早期使用時(shí)，快速方法應(yīng)與藥典方法平行進(jìn)行，在獲得充分的比對(duì)數(shù)據(jù)后，結(jié)合無菌生產(chǎn)全過程的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估設(shè)計(jì)放行策略，才有可能替代藥典方法。

（6）支原體檢查：應(yīng)在細(xì)胞培養(yǎng)物合并后洗滌前取細(xì)胞懸液進(jìn)行支原體檢查，同無菌檢查相同，在可行的情況下，首選藥典方法，但由于藥典支原體檢查時(shí)間較長(zhǎng)，因此也鼓勵(lì)研究者開發(fā)快速的支原體檢查法用于中間過程監(jiān)測(cè)或放行檢測(cè)，但在臨床試驗(yàn)過程中必須對(duì)快速方法進(jìn)行充分的驗(yàn)證，驗(yàn)證方法可參考中國(guó)藥典的相關(guān)規(guī)定及國(guó)際要求，證明所用快速方法的最低檢出限至少不能低于藥典方法。即使選用商品化的檢測(cè)試劑，在使用前也需確認(rèn)其最低檢出限不低藥典方法。在早期使用時(shí)，應(yīng)與藥典方法平行進(jìn)行，在獲得充分的比對(duì)數(shù)據(jù)后才有可能替代藥典方法。

（7）細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)：細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)應(yīng)作為CAR-T細(xì)胞的放行標(biāo)準(zhǔn)，可采用LAL法或其他新的敏感穩(wěn)定的方法，但新方法需要與家兔法進(jìn)行比較驗(yàn)證。

（8）CAR-T細(xì)胞基因組中病毒載體拷貝數(shù)的檢測(cè)：載體基因整合在T細(xì)胞基因組中，一方面顯示有T細(xì)胞進(jìn)行了CAR基因修飾，一方面又是一個(gè)安全性指標(biāo)，可能會(huì)因整合而帶來原癌基因的激活或抑癌基因的失活等造成二次腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，盡管現(xiàn)在載體的設(shè)計(jì)已經(jīng)大大降低了整合的風(fēng)險(xiǎn)，但這種風(fēng)險(xiǎn)仍未完全消除，因此需要對(duì)整合到細(xì)胞基因組中的病毒拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，在收獲時(shí)取CAR-T細(xì)胞懸液進(jìn)行檢測(cè)，目前認(rèn)為不高于5拷貝/細(xì)胞是可以接受的。但需注意的是，這一檢測(cè)項(xiàng)目反映的是群體的平均值，不是每個(gè)細(xì)胞的實(shí)際情況，因此，在臨床試驗(yàn)過程中還需要繼續(xù)密切關(guān)注因CAR基因整合帶來的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

（9）CAR-T細(xì)胞基因組中載體整合位點(diǎn)的檢測(cè)：此項(xiàng)檢測(cè)主要是評(píng)價(jià)載體在T細(xì)胞中不會(huì)產(chǎn)生熱點(diǎn)整合而造成二次腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，如在腫瘤基因或抑癌基因發(fā)生整合，但由于此項(xiàng)研究與載體設(shè)計(jì)等相關(guān)，因此，可作為產(chǎn)品質(zhì)量控制研究的內(nèi)容，可暫時(shí)不做為過程控制或產(chǎn)品放行的標(biāo)準(zhǔn)。在臨床試驗(yàn)期間進(jìn)行多個(gè)體數(shù)據(jù)的分析，獲得載體整合的特點(diǎn)并進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估后，再確定是否有必要作為每批產(chǎn)品的質(zhì)量檢測(cè)項(xiàng)目。

（10）RCR/RCL檢測(cè)：因該項(xiàng)檢測(cè)在病毒載體的階段做了充分的檢測(cè)，在CAR-T細(xì)胞質(zhì)控時(shí)可考慮主要采用PCR法或其它快速法檢測(cè)放行，但在早期研究時(shí)，建議積累足夠的數(shù)據(jù)來支持這種質(zhì)控策略。

（11）工藝殘留物檢測(cè)：應(yīng)建立細(xì)胞治療產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中添加的肽、蛋白及試劑殘留量的檢測(cè)方法，如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、抗體、磁珠、血清的殘留量檢測(cè)以及細(xì)胞碎片等的檢測(cè)。根據(jù)工藝驗(yàn)證的結(jié)果以及添加成份的風(fēng)險(xiǎn)，確定是否作為質(zhì)量檢驗(yàn)項(xiàng)目及CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品放行標(biāo)準(zhǔn)。

（12）CAR-T細(xì)胞中腫瘤細(xì)胞殘留的檢測(cè)：對(duì)于CAR-T來說，在臨床試驗(yàn)過程中還應(yīng)開展 CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品中腫瘤細(xì)胞殘留特別是被轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)方法研究，建立敏感的檢測(cè)方法并限定腫瘤細(xì)胞的殘留水平。

（13）人源病毒因子檢測(cè)：主要適用于異體CAR-T細(xì)胞，如工藝驗(yàn)證時(shí)證明培養(yǎng)過程不會(huì)造成傳染性疾病因子的擴(kuò)增，可不作為產(chǎn)品放行要求。 5   CAR- T細(xì)胞產(chǎn)品如何留樣更為合理？為便于質(zhì)量檢測(cè)及留樣，是否可以將需在最終包裝中檢測(cè)的項(xiàng)目分裝在非最終包裝容器中？

對(duì)于異體CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品來說，因其具有貨架期產(chǎn)品的特性，其批量可以滿足質(zhì)量檢測(cè)的要求，因此，留樣要求與其他生物制品的要求相同。

對(duì)于自體CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品來說，其單批次數(shù)量有限，因此可根據(jù)前述檢測(cè)項(xiàng)目設(shè)置的考慮，有些項(xiàng)目可采用過程樣品替代最終細(xì)胞產(chǎn)品留樣。但需要在最終包裝中檢測(cè)的項(xiàng)目，因?yàn)榘b材料同樣會(huì)影響產(chǎn)品的質(zhì)量，除非能證明非最終包裝容器與最終包裝容器對(duì)CAR-T細(xì)胞的影響完全一致，否則不能替代。

6   是否要開展CAR- T細(xì)胞穩(wěn)定性研究？

是的，同其他生物制品一樣，CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的穩(wěn)定性研究是其產(chǎn)品效期、運(yùn)輸條件規(guī)定的依據(jù)，需要開展穩(wěn)定性研究，包括保存條件穩(wěn)定性研究及運(yùn)輸穩(wěn)條件的穩(wěn)定性研究。

但因CAR-T細(xì)胞的批量有限，即使是異體 CAR-T細(xì)胞，其最終包裝規(guī)格的批量也不能滿足現(xiàn)有生物制品穩(wěn)定性研究指導(dǎo)原則的要求，包括長(zhǎng)期穩(wěn)定性研究，而且對(duì)于凍存條件下保存細(xì)胞來說，已有科學(xué)數(shù)據(jù)并不支持加速穩(wěn)定性及強(qiáng)制條件穩(wěn)定性的研究，因此，尚需另行建立CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品穩(wěn)定性研究的要求。

七   C AR - T細(xì)胞的非臨床研究

本部分主要基于藥品審評(píng)中心《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》非臨床研究部分和《當(dāng)前對(duì)CAR-T類產(chǎn)品非臨床研究與評(píng)價(jià)的一些考慮》的一般原則，參考國(guó)外已上市產(chǎn)品相關(guān)信息，對(duì)CAR-T類產(chǎn)品非臨床研究實(shí)施過程中的具體技術(shù)問題進(jìn)行討論。

作為一種可特異性識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞的人源T淋巴細(xì)胞產(chǎn)品，現(xiàn)有的非臨床研究方法及標(biāo)準(zhǔn)在CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的評(píng)價(jià)上存在一定的局限性，需要進(jìn)行多種新的非臨床研究評(píng)價(jià)策略和方法的探索。CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的非臨床研究可能包括如下研究?jī)?nèi)容：1）體外藥效學(xué)研究（見六.4.（4）質(zhì)量研究部分）；2）動(dòng)物體內(nèi)藥效學(xué)研究；3）藥代動(dòng)力學(xué)研究，關(guān)注目標(biāo)細(xì)胞在體內(nèi)增殖、分布和存續(xù)時(shí)間；4）非臨床安全性研究，主要包括一般毒性研究（以常規(guī)毒理學(xué)檢測(cè)終點(diǎn)為主要觀察指標(biāo)的單次給藥和/或多次給藥毒性研究）、以神經(jīng)系統(tǒng)為主的安全藥理研究、局部耐受性和體外溶血研究等制劑安全性研究以及免疫毒性研究等。受CAR-T 細(xì)胞免疫學(xué)特性和相關(guān)動(dòng)物模型可獲得性的限制，參考國(guó)內(nèi)外關(guān)于CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品研發(fā)的實(shí)例和監(jiān)管文件，如已有臨床數(shù)據(jù)經(jīng)過評(píng)估后可保證臨床受試者安全性，CAR-T產(chǎn)品的非臨床研究可能獲得部分免除。因此，進(jìn)行哪些非臨床研究需要根據(jù)每個(gè)品種的具體研發(fā)程度決定。

1   非臨床研究的一般原則

（1）CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品非臨床研究的受試物來源包括哪些？

用于非臨床研究的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品一般不必要使用患者的血液進(jìn)行制備。研究使用的細(xì)胞樣本可采用健康志愿者捐贈(zèng)的血液制備。當(dāng)無法使用臨床擬用產(chǎn)品時(shí)，采用動(dòng)物來源替代產(chǎn)品進(jìn)行一些概念驗(yàn)證性研究（Proof-of-Concept）也具有重要意義。

（2）目前常用的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的非臨床研究動(dòng)物模型有哪些？

CAR-T 細(xì)胞作為人源細(xì)胞產(chǎn)品，給予免疫功能正常的動(dòng)物時(shí)會(huì)發(fā)生免疫應(yīng)答，導(dǎo)致人源細(xì)胞被清除或者出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)，從而無法獲得對(duì)臨床有充分預(yù)測(cè)意義的有效性和安全性信息。因此，需要根據(jù)研究目的選擇適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬。目前，已用于CAR-T產(chǎn)品研究和正處于探索階段的動(dòng)物模型有如下幾種：

1）同源小鼠模型（Syngeneic Mouse）

同源小鼠模型具有完整的免疫系統(tǒng)，可以負(fù)荷鼠源腫瘤。鼠源CAR-T細(xì)胞可以靶向性地與其體內(nèi)鼠腫瘤相關(guān)抗原（Tumor Associated Antigen， TAA）結(jié)合，其組織也可能表達(dá)低水平的靶抗原，因此可以更好的用于檢測(cè)靶向和脫靶毒性。但是僅限用于研究鼠源細(xì)胞制備的CAR-T產(chǎn)品。

 2）轉(zhuǎn)基因小鼠（Transgenic Mouse）

轉(zhuǎn)基因小鼠為免疫系統(tǒng)正常鼠，表達(dá)人TAA。在研究針對(duì)不同TAA的CAR-T的同時(shí)可以保留宿主免疫系統(tǒng)，但研究對(duì)象細(xì)胞需要為鼠源細(xì)胞。該模型適合用于CAR-T細(xì)胞的概念驗(yàn)證性研究，但是無法提供人源CAR-T細(xì)胞的藥效和安全性的直接證據(jù)。

（3）移植瘤小鼠模型（Human Xenograft Mouse）

在免疫缺陷小鼠中移植人源腫瘤，可用來研究人源CAR-T細(xì)胞對(duì)人源腫瘤的作用，是一種更加直接的概念驗(yàn)證性研究，也可以在研發(fā)早期階段用于測(cè)試不同的設(shè)計(jì)類型的CAR（例如，引入不同的信號(hào)分子或者細(xì)胞因子）的藥效研究。

 4）免疫系統(tǒng)重建人源化小鼠（HIS小鼠， Humanized Immune System mice, HIS mice）

該模型通過向免疫缺陷鼠移植人免疫細(xì)胞制備得來。通常是在對(duì)免疫缺陷鼠進(jìn)行CAR-T細(xì)胞治療前移植人CD34⁺造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞  （Human CD34⁺ Hematopoietic Stem / Progenitor Cells，CD34⁺ HSPCs）。HSPCs可以再生少量髓系和部分淋巴系細(xì)胞。向免疫缺陷鼠移植人的骨髓、肝臟和胸腺的人源化BLT（fetal bone marrow， liver， thymus）小鼠模型，其構(gòu)建更加復(fù)雜，是目前最接近人免疫系統(tǒng)的動(dòng)物模型，曾被用于治療HIV的CAR-T細(xì)胞的研究，然而，該模型具有髓系細(xì)胞發(fā)育不全和T細(xì)胞欠缺的缺點(diǎn)，且目前很難實(shí)現(xiàn)大批量生產(chǎn)和標(biāo)準(zhǔn)化。

5）靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型（Primate）

猴免疫系統(tǒng)和生理學(xué)功能與人接近，理論上可交叉識(shí)別人和猴特異性抗原的CAR-T產(chǎn)品，可以模擬細(xì)胞因子風(fēng)暴（Cytokine Release Syndrome， CRS）和神經(jīng)毒性等臨床上發(fā)現(xiàn)的毒性反應(yīng)。但是在猴體內(nèi)移植人源腫瘤較為困難，當(dāng)猴TAA無法被 CAR識(shí)別時(shí)，CAR-T細(xì)胞無法活化，在體內(nèi)存續(xù)時(shí)間短；同時(shí)，人源細(xì)胞在猴體內(nèi)可能會(huì)被免疫排斥，無法充分評(píng)價(jià)其藥效或者無法充分評(píng)價(jià)其藥效或者毒性反應(yīng)。

上述動(dòng)物模型各有優(yōu)缺點(diǎn)，采用不同的模型進(jìn)行不同目的和不同類型的非臨床研究，可以獲得更多的有效性和安全性信息。

2 CAR- T細(xì)胞產(chǎn)品的藥效學(xué)研究

（1）如何選擇藥效學(xué)評(píng)價(jià)研究的動(dòng)物模型？

目前常用移植瘤小鼠模型研究CAR-T細(xì)胞對(duì)腫瘤的抑制作用。同源小鼠模型和轉(zhuǎn)基因小鼠模型具有完整的免疫系統(tǒng)，在已建立與人源腫瘤相匹配的鼠源腫瘤模型的基礎(chǔ)上，可在一定程度上反映宿主對(duì)CAR-T細(xì)胞的免疫反應(yīng)。這兩種模型適合開展概念驗(yàn)證性研究，且受試物需要是鼠源CAR-T產(chǎn)品。對(duì)于治療淋巴細(xì)胞白血病或淋巴瘤的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品，可使用人源細(xì)胞，如Raji、Daudi、Nalm6、Jeko-1等細(xì)胞株，或者使用通過基因工程導(dǎo)入特異靶標(biāo)的特殊穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，如CD19-K562， CD20-K562 等在免疫缺陷嚙齒類動(dòng)物建立移植淋巴瘤模型。鼠源CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品也可使用鼠源細(xì)胞如A20等建立鼠源模型來評(píng)價(jià)。通過不同給藥途徑給予動(dòng)物腫瘤細(xì)胞可形成不同的腫瘤模型，如，尾靜脈注射可形成系統(tǒng)的（全身性）的淋巴瘤模型，皮下注射或者腹腔注射可形成局部的淋巴瘤模型。有一些研究在HIS小鼠中移植人血液系統(tǒng)腫瘤，對(duì)CAR-T細(xì)胞的藥效及毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

（2）如何選擇藥效學(xué)檢測(cè)方法和評(píng)價(jià)指標(biāo)？

生物發(fā)光成像（Bioluminescent Imaging，BLI）技術(shù)是最直觀且常用的CAR-T細(xì)胞藥效研究方法，該方法檢測(cè)表達(dá)熒光素酶的腫瘤細(xì)胞，并以熒光強(qiáng)度表示腫瘤的荷載量，是目前評(píng)價(jià)CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品體內(nèi)藥效作用的主要技術(shù)之一。BLI是一種微創(chuàng)的成像方式，廣泛應(yīng)用于分子和細(xì)胞體內(nèi)動(dòng)態(tài)檢測(cè)領(lǐng)域，例如基因表達(dá)、蛋白質(zhì)相互作用、細(xì)胞的增殖、遷移、分化以及細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的分布等。采用BLI方法可以長(zhǎng)時(shí)間檢測(cè)體內(nèi)研究中癌細(xì)胞的遷移和擴(kuò)增，也可用于評(píng)價(jià)細(xì)胞治療產(chǎn)品毒性相關(guān)的反應(yīng)。BLI所使用的熒光素酶具有高靈敏度和低背景熒光的特性，也被廣泛應(yīng)用于非侵入性疾病的監(jiān)測(cè)中。

其它常用檢測(cè)方法包括：1）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的數(shù)量；2）流式細(xì)胞術(shù)、 ELISA、MSD等免疫學(xué)方法檢測(cè)血清中與腫瘤相關(guān)的細(xì)胞因子的變化，從而間接反映藥效學(xué)結(jié)果；3）常規(guī)藥理學(xué)或病理學(xué)方法檢測(cè)腫瘤相關(guān)參數(shù)（如瘤體積、瘤重、動(dòng)物體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的定植部位）和動(dòng)物中位存活期等。動(dòng)物中位生存期（Median Survival Time）可反映CAR-T細(xì)胞的總體活性，但無法準(zhǔn)確反映CAR-T的靶向活性。進(jìn)行 CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品藥效研究時(shí)，推薦采用不同方法來體現(xiàn)其藥效，例如：對(duì)于表達(dá)CD19⁺的淋巴瘤模型，可使用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)血液、脾臟或淋巴結(jié)中CD19⁺細(xì)胞的表達(dá)量指示腫瘤荷載程度，然而流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法不能直觀地體現(xiàn)腫瘤發(fā)生后期其它各個(gè)臟器的累及情況，因此，最好也同時(shí)采用活體成像或者組織學(xué)方法進(jìn)行研究。

（3）藥效學(xué)研究如何進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)？

CAR-T細(xì)胞藥效學(xué)研究不應(yīng)局限于常規(guī)藥物藥效學(xué)研究的設(shè)計(jì)方案，而應(yīng)根據(jù)細(xì)胞的來源、產(chǎn)量等特點(diǎn)進(jìn)行科學(xué)合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。例如，用于非臨床研究的CAR-T細(xì)胞通常來源于健康志愿者的捐贈(zèng)，而源于同一捐贈(zèng)者的一次捐贈(zèng)很難制備出同時(shí)滿足藥效學(xué)和安全性評(píng)價(jià)研究的受試物的需求量。此外，使用從單一捐贈(zèng)者中獲得的T細(xì)胞生產(chǎn)的CAR-T細(xì)胞是否能夠充分代表該產(chǎn)品的藥效學(xué)結(jié)果也需審慎考慮。如果受試物來自不同的捐贈(zèng)者或者不同的采血時(shí)間，每次獲得的受試物的細(xì)胞特性等也可能存在某些未知的差異。CAR-T細(xì)胞藥效學(xué)研究要包含不同的劑量水平以體現(xiàn)量效關(guān)系。因未轉(zhuǎn)染CAR-T細(xì)胞也可能存在非特異性的腫瘤細(xì)胞殺傷作用，故除了溶媒對(duì)照外，需設(shè)置T細(xì)胞對(duì)照組（未轉(zhuǎn)導(dǎo)CAR的T細(xì)胞、模擬轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞或者半抗原特異性CAR-T細(xì)胞）。作為對(duì)照的T細(xì)胞應(yīng)盡量與研究用CAR-T細(xì)胞是同一來源且使用統(tǒng)一的生產(chǎn)流程和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。此外，建議設(shè)置不接種腫瘤的溶媒對(duì)照組以便于結(jié)果分析。條件允許時(shí)，體內(nèi)藥效試驗(yàn)建議使用來自不同捐贈(zèng)者的細(xì)胞生產(chǎn)的CAR-T細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)物藥效學(xué)研究，以評(píng)估CAR-T細(xì)胞治療效果的穩(wěn)定性。研究中可增加或者設(shè)置衛(wèi)星組用于細(xì)胞藥代動(dòng)力學(xué)（分布、遷移、歸巢及其存續(xù)和消亡特性）、細(xì)胞因子的檢測(cè)以及其它一些毒性指標(biāo)的監(jiān)測(cè)。

3 CAR- T細(xì)胞產(chǎn)品的藥代動(dòng)力學(xué)（藥代）研究

當(dāng)前腫瘤細(xì)胞專屬的靶抗原較少，而CAR-T 細(xì)胞產(chǎn)品又具有較強(qiáng)靶向細(xì)胞殺傷活性。CAR-T 細(xì)胞如果與人體內(nèi)的非腫瘤細(xì)胞結(jié)合，可引起嚴(yán)重的脫靶副反應(yīng)，甚至導(dǎo)致死亡。另一方面， CAR-T細(xì)胞的體內(nèi)效力又依賴于細(xì)胞的有效增殖及免疫記憶的形成。因此，在非臨床研究中闡明 CAR-T細(xì)胞的體內(nèi)過程對(duì)其有效性和安全性的研究至關(guān)重要。

（1）藥代研究動(dòng)物模型如何選擇？

因人源細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)會(huì)導(dǎo)致免疫排斥反應(yīng)，人源CAR-T細(xì)胞最好使用免疫缺陷動(dòng)物進(jìn)行研究。一般而言，在腫瘤細(xì)胞存在的情況下CAR-T細(xì)胞會(huì)大量增殖并發(fā)揮生物學(xué)作用，因此目前CAR-T細(xì)胞最常用的藥代研究模型為移植瘤模型。在條件允許的情況下也可增加非荷瘤模型的分布研究，以便對(duì)兩者間組織分布差異性進(jìn)行比較。

（2）CAR-T細(xì)胞的藥代（生物分布）檢測(cè)技術(shù)如何選擇？

CAR-T細(xì)胞的藥代研究主要關(guān)注目標(biāo)細(xì)胞在體內(nèi)增殖水平、分布情況和存續(xù)時(shí)間，可選擇的檢測(cè)技術(shù)包括成像技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、免疫組化技術(shù)、定量PCR技術(shù)等，不同的方法適用于不同的檢測(cè)樣本和檢測(cè)目的。成像法可以直觀地檢測(cè) CAR-T細(xì)胞的體內(nèi)分布，活體成像的細(xì)胞標(biāo)記可通過多種方法實(shí)現(xiàn)，如對(duì)細(xì)胞進(jìn)行放射性同位素標(biāo)記、遺傳修飾（如，表達(dá)綠色熒光蛋白或熒光素酶）標(biāo)記，納米粒子標(biāo)記（如，鐵-葡聚糖納米粒子）等；流式細(xì)胞術(shù)可以檢測(cè)動(dòng)物血液、骨髓和脾臟中的CAR-T細(xì)胞；免疫組化的方法可以檢測(cè)脾臟或其它臟器中CD3⁺細(xì)胞或CAR⁺細(xì)胞的表達(dá)，以提示人T細(xì)胞在動(dòng)物臟器中的分布和累積；定量 PCR方法可檢測(cè)所有類型樣本中代表人源CAR-T 細(xì)胞的DNA或者RNA水平，PCR方法推薦以CAR 而不是T細(xì)胞作為特異性檢測(cè)目標(biāo)。目前，一些新的技術(shù)方法，如，原位雜交等，也開發(fā)用于檢測(cè) CAR-T細(xì)胞的組織分布。使用上述方法對(duì)CAR-T 細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記后，是否對(duì)細(xì)胞的質(zhì)量屬性和生物學(xué)特性產(chǎn)生影響，以及是否對(duì)細(xì)胞的分布情況及其研究結(jié)果產(chǎn)生影響也值得關(guān)注。標(biāo)記細(xì)胞的生產(chǎn)工藝、質(zhì)量控制、生物學(xué)活性鑒定過程應(yīng)與非標(biāo)記細(xì)胞一致，并應(yīng)對(duì)其檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，證明是否在差異以及差異的程度，同時(shí)評(píng)價(jià)對(duì)細(xì)胞屬性可能的影響。總之，在非臨床研究中，最好用一種或多種適宜的細(xì)胞追蹤方法評(píng)價(jià)細(xì)胞產(chǎn)品的分布、遷移、歸巢及其存續(xù)和消亡特性，并闡述方法的科學(xué)性。

4 CAR- T細(xì)胞產(chǎn)品的非臨床安全性研究

已獲得的臨床研究結(jié)果顯示，CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的安全性風(fēng)險(xiǎn)主要包括：CRS、可逆的神經(jīng)毒性、B細(xì)胞減少和靶向與脫靶（On-target，Offtumor）毒性效應(yīng)等。因此，非臨床安全性的主要關(guān)注點(diǎn)為如何評(píng)價(jià)CRS，神經(jīng)毒性、靶向和脫靶毒性等。另外，產(chǎn)品制備過程中細(xì)胞在體外經(jīng)過了復(fù)雜的轉(zhuǎn)基因修飾，因此CAR-T細(xì)胞的成瘤性/致瘤性問題也是考慮重點(diǎn)之一。在非臨床動(dòng)物研究中，國(guó)內(nèi)外就上述關(guān)注點(diǎn)可進(jìn)行何種程度的預(yù)測(cè)尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，動(dòng)物毒理學(xué)研究也存在著動(dòng)物模型、種屬特異性等具有挑戰(zhàn)性的難題。

（1）CAR-T細(xì)胞的非臨床安全性研究是否需要在GLP條件下進(jìn)行？

與其它治療性藥物產(chǎn)品一致，CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品的非臨床安全性評(píng)價(jià)研究也應(yīng)遵從《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》（GLP）。對(duì)于伴隨在藥效學(xué)研究中的某些特殊指標(biāo)的檢測(cè)也可以在非GLP 條件下開展，但應(yīng)保證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性、完整性及對(duì)產(chǎn)品總體安全性評(píng)價(jià)的影響。

（2）CAR-T細(xì)胞的非臨床安全性研究中受試物分析如何進(jìn)行？

鑒于CAR-T產(chǎn)品制備過程的特殊性，委托方應(yīng)提供受試物完整的質(zhì)量分析數(shù)據(jù)報(bào)告，并應(yīng)提供覆蓋所有給藥濃度以及模擬所有運(yùn)輸過程、處理操作、直至動(dòng)物給藥前過程的受試物穩(wěn)定性研究數(shù)據(jù)。受試物在到達(dá)研究機(jī)構(gòu)后，如果在給藥前需要經(jīng)過復(fù)蘇、重懸等處理操作，研究機(jī)構(gòu)至少要對(duì)細(xì)胞形態(tài)、活細(xì)胞總數(shù)、細(xì)胞活率、顏色、除細(xì)胞之外的其它外源性異物等進(jìn)行觀察或檢測(cè)。如果受試物到達(dá)研究機(jī)構(gòu)后可以不經(jīng)處理直接給藥（在穩(wěn)定性允許的時(shí)間范圍內(nèi)），則上述檢測(cè)可以由委托方進(jìn)行。

（3）如何選擇安全性研究的動(dòng)物模型？

為提高非臨床安全性研究的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，受試物在動(dòng)物體內(nèi)過程和/或所處環(huán)境應(yīng)最大程度上模擬人體中的過程和/或環(huán)境。同源小鼠模型和表達(dá)人TAA的轉(zhuǎn)基因小鼠是免疫系統(tǒng)正常鼠，具有完整的免疫系統(tǒng)，在與人高度同源的小鼠腫瘤抗原或轉(zhuǎn)入的人腫瘤相關(guān)抗原的存在下，較適于評(píng)價(jià)產(chǎn)品的靶向與脫靶作用以及產(chǎn)品對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的影響。但其局限性在于受試的CAR-T細(xì)胞應(yīng)為鼠源細(xì)胞。此外，鼠的生物學(xué)特性和免疫系統(tǒng)有別于人，不能最大程度的反映產(chǎn)品的CRS等風(fēng)險(xiǎn)，且鼠源CAR-T細(xì)胞在此模型小鼠易發(fā)生活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，存活時(shí)間短。

移植瘤小鼠模型在免疫缺陷小鼠中移植人源腫瘤，可以作為疾病動(dòng)物模型對(duì)毒性指標(biāo)進(jìn)行觀察。其缺點(diǎn)是沒有宿主免疫系統(tǒng)，不能完全模擬人體中出現(xiàn)的CRS帶來的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，無法檢測(cè)脫靶作用。非荷瘤的免疫缺陷鼠由于缺乏免疫細(xì)胞，不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，可使CAR-T細(xì)胞在其體內(nèi)存活較長(zhǎng)時(shí)間，更適合對(duì)CAR-T細(xì)胞制劑的非靶點(diǎn)安全性風(fēng)險(xiǎn)以及成瘤性/致瘤性進(jìn)行研究。

HIS小鼠模型可以在動(dòng)物體內(nèi)較好地模擬人免疫系統(tǒng)，在評(píng)價(jià)CAR-T細(xì)胞安全性方面頗具前景。但該模型尚處于初期研究階段，模型的統(tǒng)一和標(biāo)準(zhǔn)化尚存在難點(diǎn)。比如，CD34⁺ HSPCs細(xì)胞的來源包括多種途徑，如成人骨髓、外周血、臍帶血和胎兒肝臟，而不同來源細(xì)胞產(chǎn)生的動(dòng)物模型可能對(duì) CAR-T細(xì)胞評(píng)價(jià)的結(jié)果產(chǎn)生影響；由于安全性研究需要的動(dòng)物數(shù)較多，往往同一實(shí)驗(yàn)需要使用多個(gè)供體來源的CD34⁺ HSPCs細(xì)胞，重建后的小鼠個(gè)體嵌合程度也可能不同，上述因素都可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)個(gè)體差異程度增加；另外，人CD34⁺ HSPCs細(xì)胞在小鼠體內(nèi)分化的骨髓和淋巴細(xì)胞與在人體內(nèi)分化的同類細(xì)胞比較存在很大區(qū)別，由其建立的人免疫系統(tǒng)還很不完善，隨時(shí)間推移，其自發(fā)病的發(fā)生率也比免疫缺陷小鼠更高。總之，目前人源化小鼠模型的應(yīng)用仍以探索性為主，尚不能全面應(yīng)用到非臨床研究中。

猴免疫系統(tǒng)和生理功能與人接近，但多數(shù)情況下因?yàn)槊庖咴缘膯栴}，無法在猴體內(nèi)對(duì)人源 CAR-T進(jìn)行長(zhǎng)期毒性的研究。目前使用猴開展 CAR-T研究應(yīng)用的例子很少。為降低免疫排斥，可同時(shí)給予動(dòng)物免疫抑制劑，但可對(duì)CAR-T的安全性研究結(jié)果產(chǎn)生干擾。

（4）常規(guī)毒理學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的考慮要點(diǎn)？

一般可使用免疫缺陷動(dòng)物或者荷瘤鼠模型單獨(dú)進(jìn)行較全面的毒理學(xué)研究，也可在藥效學(xué)研究的同時(shí)，設(shè)計(jì)衛(wèi)星組進(jìn)行毒性指標(biāo)的檢測(cè)（包括常規(guī)毒理學(xué)指標(biāo)，如臨床癥狀、體重、攝食量、血液學(xué)、血清生化、病理學(xué)檢查、細(xì)胞因子檢測(cè)等）。因免疫缺陷動(dòng)物或者荷瘤鼠模型不是毒理學(xué)研究常規(guī)使用動(dòng)物，在研究過程中應(yīng)密切關(guān)注各項(xiàng)背景數(shù)據(jù)以及荷瘤可能帶來的病理、生理指標(biāo)變化。

劑量組別和給藥方案：低劑量應(yīng)不低于臨床等效劑量。因?yàn)椴煌?/span>CAR-T細(xì)胞轉(zhuǎn)染率不一致，靜脈給藥時(shí)高劑量應(yīng)以輸入動(dòng)物體內(nèi)的總細(xì)胞數(shù)不引起動(dòng)物輸液反應(yīng)（總細(xì)胞數(shù)不能過大）和肺栓塞為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行設(shè)計(jì)。應(yīng)至少包含兩個(gè)或兩個(gè)以上劑量，給藥應(yīng)等于或大于臨床給藥次數(shù)。毒性研究設(shè)計(jì)包括至少兩個(gè)劑量組，不同的劑量可以是來源于同一捐贈(zèng)者的不同劑量的細(xì)胞，也可以是分別來源于不同受試者的同一劑量（較高劑量）的細(xì)胞。與藥效學(xué)研究相同，除了設(shè)置溶媒對(duì)照組，也可以設(shè)置T細(xì)胞對(duì)照組方便結(jié)果分析。如使用荷瘤鼠模型進(jìn)行毒性研究，可根據(jù)研究機(jī)構(gòu)的背景數(shù)據(jù)考慮設(shè)置非荷瘤對(duì)照組。

給藥次數(shù)：CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品毒性研究不能遵循常規(guī)的設(shè)計(jì)思路。可以在單次或多次給藥后，在不同的檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行全面的毒性指標(biāo)的檢測(cè)。如果CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品在臨床上為單次給藥，動(dòng)物試驗(yàn)時(shí)可在不產(chǎn)生免疫原性或者免疫耐受的時(shí)間點(diǎn)內(nèi)進(jìn)行第二次甚至更多次的給藥，然而是否可以進(jìn)行多次給藥，以及給藥次數(shù)的確定需根據(jù)不同CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的作用特點(diǎn)充分論證后決定。

試驗(yàn)周期和檢測(cè)時(shí)間：在CAR-T的安全性研究中，可能不適合使用“給藥結(jié)束”和“恢復(fù)期結(jié)束”等毒理學(xué)常規(guī)的檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)的概念。如在采用荷瘤鼠的毒性研究中，第一次剖檢時(shí)間（一般意義上的“給藥結(jié)束”時(shí)間點(diǎn)）可以選擇未經(jīng)治療荷瘤鼠的生存期限（2~3周）、臨床出現(xiàn)CRS等嚴(yán)重毒性反應(yīng)的時(shí)間或者CAR-T細(xì)胞發(fā)揮最強(qiáng)生物學(xué)活性作用的時(shí)間點(diǎn)，檢測(cè)受試物潛在的短期毒性反應(yīng)和靶器官。以藥代研究所顯示的細(xì)胞存續(xù)時(shí)間或者荷瘤動(dòng)物在受試物作用后的最長(zhǎng)存活時(shí)間，作為第二次剖檢時(shí)間點(diǎn)（一般意義上的“恢復(fù)期結(jié)束”時(shí)間點(diǎn)），考察CAR-T細(xì)胞長(zhǎng)期、延遲毒性和致瘤性風(fēng)險(xiǎn)。

檢測(cè)指標(biāo)：因?yàn)槊庖呷毕菔蟮臋C(jī)體狀態(tài)可能較差，荷瘤鼠模型處于嚴(yán)重疾病狀態(tài)，各種檢測(cè)樣本（例如血液量）的量通常不能滿足等常規(guī)檢測(cè)指標(biāo)的需要，可以減少一些不必要的指標(biāo)或者設(shè)計(jì)更多的動(dòng)物數(shù)來滿足對(duì)樣本量的需求。

（5）CAR-T細(xì)胞的非臨床安全性研究中是否需要進(jìn)行伴隨毒代動(dòng)力學(xué)研究？

CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的非臨床安全性研究通常使用免疫缺陷小動(dòng)物模型，進(jìn)行伴隨毒代動(dòng)力學(xué)研究時(shí)需要設(shè)置衛(wèi)星組動(dòng)物，對(duì)動(dòng)物數(shù)目的需求較大。單一捐贈(zèng)者來源的或者單次制備的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的量往往不能滿足伴隨毒代研究的需求。同時(shí)，有些CAR-T產(chǎn)品毒性研究可能伴隨藥效學(xué)研究開展。因此，認(rèn)為在個(gè)體化的CAR-T產(chǎn)品研發(fā)中，不強(qiáng)制性要求一定要在毒性研究的同時(shí)伴隨進(jìn)行毒代研究，可以將藥代和毒代研究結(jié)合進(jìn)行，有時(shí)單獨(dú)的藥代研究能很好反應(yīng)細(xì)胞體內(nèi)過程的情況下，可以兼用于毒代研究。毒（藥）代研究可以在毒性或藥效研究同時(shí)進(jìn)行，采用同一批細(xì)胞產(chǎn)品，也可以采用不同批次的細(xì)胞產(chǎn)品分開進(jìn)行。

（6）免疫毒性評(píng)價(jià)研究如何進(jìn)行？

已有的臨床研究結(jié)果和CAR-T治療的原理顯示CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品必然具有免疫毒性，目前研究結(jié)果也顯示免疫毒性，如CRS等，與細(xì)胞治療的效果顯著相關(guān)。然而，因非臨床研究中尚無可以直接預(yù)測(cè)人CAR-T細(xì)胞的臨床免疫毒性風(fēng)險(xiǎn)的理想的動(dòng)物模型，因此需要對(duì)不同動(dòng)物模型中獲得的免疫毒性檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行客觀的分析，以評(píng)價(jià)其預(yù)測(cè)能力。CAR-T細(xì)胞在非臨床免疫毒性檢測(cè)指標(biāo)大致包括：采用流式細(xì)胞方法、Luminex、MSD電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)等方法檢測(cè)血清細(xì)胞因子水平（如IL-2、 IL-4、IL-6、IL-10、INF-γ、TNF-α等），以期待反映CAR-T細(xì)胞的CRS風(fēng)險(xiǎn)；根據(jù)使用動(dòng)物模型的不同，檢測(cè)動(dòng)物外周血中淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)及表型分析（如CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺等）；異種細(xì)胞移植物抗宿主反應(yīng)（Graft-versus-Host Reaction，GvHR）的觀察和與臨床研究可能相關(guān)性的科學(xué)評(píng)價(jià)；免疫器官檢查（重量、大體和組織病理檢查）。免疫毒性的檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)需要根據(jù)CAR-T作用機(jī)制和不同的動(dòng)物模型以及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)。

（7）神經(jīng)毒性如何考察？

可以在適當(dāng)模型上進(jìn)行神經(jīng)毒性考察。常規(guī)的安全藥理學(xué)功能觀察試驗(yàn)組合（Functional Observation Battery，F(xiàn)OB）研究設(shè)計(jì)（給藥次數(shù)，給藥周期，檢測(cè)頻率）等不一定適合CAR-T細(xì)胞的作用特點(diǎn)，根據(jù)采用動(dòng)物種屬或模型的不同，可以設(shè)計(jì)多次給藥或者延長(zhǎng)觀察期以考察神經(jīng)毒性。此外，應(yīng)盡可能與其它毒性研究相結(jié)合，重點(diǎn)觀察神經(jīng)毒性。CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)生的神經(jīng)毒性可能與CRS具有相關(guān)性，認(rèn)為是CRS損傷血腦屏障，血管內(nèi)皮受損，細(xì)胞因子進(jìn)入腦內(nèi)導(dǎo)致的。因此，可以考慮在臨床研究中出現(xiàn)CRS的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行一次FOB的觀察。另外，對(duì)于在不能很好模擬 CRS的動(dòng)物模型中進(jìn)行的神經(jīng)毒性考察的意義有待審慎考慮。

（8）致瘤性研究如何進(jìn)行？

作為一種終末分化的體細(xì)胞治療產(chǎn)品，理論上CAR-T細(xì)胞成瘤性/致瘤性風(fēng)險(xiǎn)較低。體外評(píng)價(jià)方法軟瓊脂克隆試驗(yàn)可通常表現(xiàn)為陰性結(jié)果。在基因組插入位點(diǎn)分析中，因插入是隨機(jī)的，每例患者的插入位點(diǎn)可能不盡相同；即使插入位點(diǎn)為可能致瘤的位點(diǎn)，隨著CAR-T細(xì)胞死亡或體內(nèi)對(duì)CAR-T 細(xì)胞的免疫應(yīng)答，也無法確定其致瘤性。但對(duì)于導(dǎo)入了外源基因的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品，需通過病毒載體插入人基因組的插入位點(diǎn)分析、體外細(xì)胞永生化增殖、體內(nèi)研究中異常/異位增生性病變（如增生、腫瘤）等研究初步評(píng)估其致瘤性風(fēng)險(xiǎn)。體內(nèi)致瘤性研究可與較長(zhǎng)周期的動(dòng)物毒理學(xué)研究伴隨開展，可以在臨床試驗(yàn)期間完成。

結(jié)束語

由于CAR-T領(lǐng)域正處于飛速發(fā)展階段，不斷有新的思路及新的技術(shù)進(jìn)入該領(lǐng)域，人們對(duì)它的科學(xué)認(rèn)識(shí)也在不斷深入，同時(shí)，對(duì)它的風(fēng)險(xiǎn)的認(rèn)識(shí)也在臨床試驗(yàn)及臨床應(yīng)用過程中不斷積累，因此，對(duì) CAR-T的制備工藝的提高、質(zhì)量控制的考慮及檢測(cè)要求，以及非臨床研究的要求都會(huì)不斷改進(jìn)，本技術(shù)考慮要點(diǎn)也會(huì)隨著這些發(fā)展進(jìn)行定期的修訂，以更好地促進(jìn)我國(guó)CAR-T領(lǐng)域的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

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起草單位及起草人：

中國(guó)食品藥品檢定研究院生物制品檢定所：孟淑芳、王佑春、吳雪伶、趙翔、黃維金、王斌、王萌、宋雪、賈芳英

中國(guó)食品藥品檢定研究院安全評(píng)價(jià)研究所：霍艷、侯田田、黃瑛、文海若、李芊芊、屈哲

中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院及北京永泰免疫生物制品有限公司：王歈

華東師范大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與技術(shù)研究所及上海優(yōu)卡迪生物技術(shù)有限公司：俞磊

提出意見及建議的單位：

中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)陳志南院士；中國(guó)食品藥品檢定研究院李波、王軍志；中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)萬濤；中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)錢其軍；上海市腫瘤研究所李宗海；國(guó)家藥典委員會(huì)郭中平；中國(guó)食品藥品檢定研究院安全評(píng)價(jià)研究所王雪、張河戰(zhàn)；第二軍醫(yī)大學(xué)袁伯?。卉娛箩t(yī)學(xué)科學(xué)院廖明陽；上海市食品藥品檢驗(yàn)所林梅、陳鋼、邵泓；上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院王文博；北京永泰生物制品有限公司孫磊；艾森生物（杭州）有限公司葉佩芳、陳業(yè)、燕宇；重慶精準(zhǔn)生物技術(shù)有限公司錢程、張茜真、楊智、沈俊杰；華道（上海）生物醫(yī)藥有限公司余學(xué)軍、陳鑫；南京馴鹿醫(yī)療技術(shù)有限公司鄒勇、胡廣、趙弘燁；普瑞金深圳生物技術(shù)有限公司張繼帥、陳澤建；英普樂孚生物技術(shù)（上海）有限公司梅衛(wèi)玲；上海細(xì)胞治療集團(tuán)孫艷；復(fù)星凱特生物科技有限公司孫敏敏、沈青山；上海尚珞生物醫(yī)藥科技有限公司答亮；西比曼生物科技（上海）有限公司任加強(qiáng)、鄭茂發(fā)、陸吉順、呂曉騰、吳軍峰；南京傳奇生物科技有限公司蔣忻坡；上海恒潤(rùn)達(dá)生生物科技有限公司何風(fēng)；科濟(jì)生物醫(yī)藥（上海）有限公司夏春秀、劉超；上海明聚生物科技有限公司 姚樹元；中山大學(xué)劉炳峰；博生吉安科細(xì)胞技術(shù)有限公司汪敏、游鳳濤；中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)李玲、汪世婕；康龍化成（北京）新藥技術(shù)研發(fā)公司汪巨峰；山東欣博藥物研究有限公司沈連忠；成都華西海圻醫(yī)藥科技有限公司岑曉波、王莉；北京昭衍新藥研究中心股份有限公司孫云霞；上海益諾思生物技術(shù)有限公司馬璟；北京協(xié)和建昊醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司魏金鋒；江蘇鼎泰藥物研究股份有限公司張雪峰；蘇州賽泰醫(yī)療技術(shù)有限公司；北京藝妙醫(yī)療科技有限公司魯新安。