（1）收獲/澄清

貼壁體系的料液為細(xì)胞培養(yǎng)上清，含有少量的細(xì)胞或細(xì)胞碎片，料液濁度相對(duì)較低。此次收獲料液的初始濁度為26NTU。

濾器測(cè)試結(jié)果分別從濾后收率、濁度和載量三個(gè)方面進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示。不同濾器澄清料液的收率均在90%以上，孔徑越小，收率越高。Sartopure PP3 0.45μm 濾器對(duì)料液濁度的處理效果最佳，濾后料液濁度小于10NTU，更有利于后續(xù)工藝的進(jìn)一步處理。從載量上來看，玻纖材質(zhì)的濾器載量最高，其次是聚丙烯材質(zhì)的濾器。綜合比較可以看出，對(duì)于貼壁料液或濁度較低的料液，可以通過Sartopure PP3 0.45μm濾器進(jìn)行一步澄清，既保障了澄清工藝的收率和載量，同時(shí)料液的降濁效果也可滿足工藝要求。

圖2 不同濾器澄清后料液濁度、收率、載量的比較結(jié)果

此外，懸浮培養(yǎng)的收獲料液，因含有大量的懸浮細(xì)胞或細(xì)胞碎片使得料液濁度較高，通?？蛇_(dá)數(shù)百NTU。對(duì)于此類料液，通常有兩種處理方案，一種是離心+澄清過濾（如離心+Sartopure PP3 0.45μm），另一種是多種不同孔徑的濾器組合進(jìn)行多級(jí)過濾（如Sartopure PP3 8μm +Sartopure PP3 0.45μm）。通常在料液體積較小時(shí)選擇第一種方案，操作便捷高效；當(dāng)料液體積增大后，考慮到大型離心機(jī)的成本投入以及一次性工藝的可擴(kuò)展性，更多的會(huì)選擇多級(jí)濾器組合使用。

（2）超濾

澄清后的病毒料液中含有核酸酶、宿主細(xì)胞蛋白等雜質(zhì)，通過超濾濃縮換液可以在減少料液體積的同時(shí)，去除部分小分子量雜質(zhì)并置換為層析緩沖液，為后續(xù)層析純化工藝做準(zhǔn)備。此外超濾也可以應(yīng)用在層析工藝后，置換為慢病毒保存液，提高病毒穩(wěn)定性。

中空纖維和膜包是慢病毒超濾工藝中常用的超濾介質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)中我們?cè)谫惗嗬筍ARTOFLOW smart超濾系統(tǒng)中通過優(yōu)化剪切力、切向流速、跨膜壓等參數(shù)，分別測(cè)試了Hollow Fiber 750KD、膜包Hydrosart 300KD（E，寬流道）、Hydrosart 300KD（ECO，窄流道）處理貼壁體系和懸浮體系澄清料液的效果。

結(jié)果如圖3所示，在處理貼壁體系或懸浮體系的澄清料液時(shí)，在載量相同時(shí)Hollow Fiber750KD收率都是高于膜包的，收率可達(dá)80%以上；但是膜包的通量均優(yōu)于Hollow Fiber750KD，且寬流道膜包通量高于窄流道膜包，通量影響了工藝時(shí)長，往往會(huì)進(jìn)一步影響慢病毒活性。因此在超濾工藝進(jìn)行耗材的選擇時(shí)需要綜合評(píng)估料液體積、工藝時(shí)長、工藝收率、工藝成本等因素，我們選擇在層析前的超濾濃縮工藝中選擇膜包Hydrosart 300KD（E），在層析后超濾置換工藝中選擇Hollow Fiber750KD。

圖3 中空纖維和膜包處理多批慢病毒料液的數(shù)據(jù)對(duì)比

（3） 除菌

慢病毒顆粒直徑約100nm, 與除菌濾器孔徑0.2μm非常接近。若料液存在病毒聚集體或雜質(zhì)殘留較多，會(huì)導(dǎo)致病毒被攔截或吸附在濾膜上降低除菌工藝收率。有研究文章報(bào)道，慢病毒料液除菌工藝的收率做到了80%以上，然而在實(shí)際操作中挑戰(zhàn)很大。

基于前期數(shù)據(jù)積累，在本項(xiàng)目中，我們選用賽多利斯Sartopore 2濾器進(jìn)行過濾除菌。該濾器是聚醚砜材質(zhì)的雙層孔徑膜（0.45μm+0.2μm），相比于單層膜可以提高過濾載量。A組、B-1組和B-2組料液來自貼壁培養(yǎng)，收率均在60%以上，最高收率為72.3%，載量均＞50L/㎡，最高可接近100L/㎡。C組料液來自懸浮培養(yǎng)，工藝收率雖略低于A/B組實(shí)驗(yàn)，但仍保持在50%以上，載量大于60L/㎡。由此可見，慢病毒上游工藝和下游前處理工藝對(duì)最終除菌工藝的收率有明顯影響，Sartopore 2除菌濾器在貼壁體系及懸浮體系慢病毒過濾除菌工藝中表現(xiàn)較為出色。

圖4 濾器Sartopore 2在除菌工藝的優(yōu)化結(jié)果

總結(jié)

在該研究中，我們將澄清濾器“膜”、超濾“膜”（中空纖維柱或膜包）以及除菌濾器“膜”接力應(yīng)用，貼壁體系慢病毒下游純化工藝中這三步工藝的綜合收率已超過60%！極大地保證了慢病毒下游工藝整體收率。同時(shí)，懸浮體系收獲液的下游工藝收率也得到提升。

致謝：

本項(xiàng)目由麗山生物提供產(chǎn)品料液、實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地及設(shè)備，賽多利斯提供濾器、中空纖維/膜包及除菌濾器，麗山生物團(tuán)隊(duì)與賽多利斯工藝開發(fā)團(tuán)隊(duì)共同合作完成，感謝賽多利斯工藝開發(fā)團(tuán)隊(duì)的大力支持。

麗山生物作為麗山健康(山東)集團(tuán)有限公司的全資子公司，擁有山東省首家由省科技廳認(rèn)可的免疫細(xì)胞與基因治療CDMO中試基地，依托山東省免疫細(xì)胞與基因治療CDMO中試基地、濟(jì)南(麗山)區(qū)域細(xì)胞組織庫及細(xì)胞制備中心、基因測(cè)序與合成中心三大產(chǎn)業(yè)平臺(tái)，聚焦免疫細(xì)胞治療、基因治療、干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)檢測(cè)等業(yè)務(wù)，高效賦能生物醫(yī)藥技術(shù)創(chuàng)新，為濟(jì)南市生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展貢獻(xiàn)堅(jiān)實(shí)“麗"量。