一文讀懂AAV基因治療

什么是基因治療

在了解基因治療之前，首先讓我們來復習下什么是基因？什么是基因突變？

人體由數(shù)萬億個細胞組成。細胞是所有生物的基本組成部分，每個細胞的指揮中心叫做細胞核，它包含染色體。

染色體是由身體的遺傳物質(zhì)DNA構(gòu)成的。而基因就是控制性狀的基本遺傳單位，除某些病毒的基因由RNA構(gòu)成以外，多數(shù)生物的基因由DNA構(gòu)成。簡單點說，基因是有遺傳效應的DNA或RNA片段。

既然基因是攜帶遺傳信息的DNA，那就可以通過編碼指導蛋白質(zhì)的合成來表達自己所攜帶的遺傳信息，進而在細胞中實現(xiàn)絕大部分功能。這一作用機理遵循中心法則：DNA轉(zhuǎn)錄為mRNA再翻譯為蛋白質(zhì)。

所謂基因突變，不難理解就是基因的DNA序列發(fā)生了變化，如基因替換、插入或缺失等。一旦發(fā)生這樣的突變就可能導致某些必需的蛋白質(zhì)不能產(chǎn)生或者不能正常工作，從而引發(fā)一些疾病。

不少癌變及遺傳性疾病等就是因為體內(nèi)某種基因缺陷或突變引起的，如：

我們所說的基因治療（gene therapy）是指將外源正?；蛲ㄟ^基因轉(zhuǎn)移技術(shù)導入靶細胞或通過基因編輯技術(shù)對靶細胞內(nèi)基因組進行改造，以糾正或代償基因缺陷和異常引起的疾病，最終達到治療目的的一種生物治療方法。

對應治療方法主要3種：

1）用正?；蛱鎿Q致病基因；

2）引入新的基因或修飾改造原有基因；

3）使不能正常工作的基因失活。

有了外源正?；颍绾螌⑵湟爰毎?？直接導入肯定不切實際，因為游離的DNA進入細胞后一般會直接被分解。就算可以進行轉(zhuǎn)錄，翻譯成蛋白，游離的DNA也無法跟著細胞分裂進行復制，就會導致子代細胞中不再含有目的基因。換句話說，你費力將基因?qū)胧荏w細胞,結(jié)果只有一個細胞被改變了，整個群體細胞不會有任何變化。

這時候就需要一種叫做“載體”的工具來幫助穩(wěn)定轉(zhuǎn)運，將基因傳遞到細胞中。下面我們就一起來了解下都有哪些載體可以用于基因治療。

基因治療載體

基因治療載體有兩個重要功能——一個是保護殼內(nèi)的脆弱“貨物”，第二個是其表面配體與特定細胞相互作用。其種類很多，可分為病毒載體和非病毒載體。

非病毒載體由于其：

1）轉(zhuǎn)染效率不理想；

2）外源基因轉(zhuǎn)導到宿主細胞后表達時間短；

3）非特異性靶向較高等原因，在人體靶向基因治療中使用較少。

所以基因治療常用病毒載體作為遞送系統(tǒng)，最常見的病毒載體包括腺病毒（AdV）、腺相關(guān)病毒（AAV）、逆轉(zhuǎn)錄病毒（RV）和慢病毒（LV）。

其中慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒由于其可以將外源基因隨機插入并整合到宿主細胞基因組中，存在因為隨機插入造成基因突變的風險，考慮到安全性問題，適用性并不那么廣泛。

腺病毒（AdV）是無包膜的線性雙鏈DNA病毒，腺病毒載體宿主細胞范圍廣泛，可有效感染分裂細胞和非分裂細胞，不與宿主細胞基因組整合，因而不存在插入突變風險，載體容量較大。但其也存在一些不足之處：①缺乏特異靶向性，在一些缺乏其相應受體的細胞中感染效率低；②目的基因的表達時間短，可能需要重復治療；③有較強的免疫原性，容易產(chǎn)生強烈的免疫反應帶來一定風險。

腺相關(guān)病毒（AAV）是目前發(fā)現(xiàn)的一類結(jié)構(gòu)最簡單的單鏈DNA病毒。其相較于腺病毒免疫源性低，另外由于其安全性好、宿主細胞范圍廣，在體內(nèi)表達外源基因時間長等特點，被視為最有前途的基因治療載體，在世界范圍內(nèi)的基因治療研究中應用最為廣泛。

下面我們就一起來詳細了解AAV是如何一步步成為基因治療中的明星載體。

腺相關(guān)病毒載體

什么是AAV ？

腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus，AAV）屬于細小病毒科，Dependoparvovirus屬，病毒表面由衣殼蛋白VP1，VP2，VP3總共60拷貝，按1：1：10比例組成的二十面體結(jié)構(gòu)，無包膜，直徑約26nm。衣殼蛋白的不同突變型產(chǎn)生了不同的AAV亞型，按血清試驗結(jié)果可以分為不同血清型，目前已有超過10種AAV血清型（AAV1～AAV10）。

其基因組為線性單鏈DNA，大小約4.7kb。基因組的兩端是兩個T形反向末端重復序列(ITR)，主要用作病毒復制起點和包裝信號。中間編碼區(qū)有2個開放閱讀框，其中Rep基因編碼病毒復制所需的四種蛋白質(zhì)：Rep78、Rep68、Rep52和Rep40（以其分子量命名）。Cap基因通過來自不同起始密碼子的可變剪接和翻譯編碼三個衣殼亞基。

什么是rAAV ？

以上所說的是野生型 AAV，其是一種復制缺陷型微小病毒，需要腺病毒或皰疹病毒幫助其在體內(nèi)復制擴增。而基因治療中所用的是不需要輔助病毒的重組腺相關(guān)病毒（Recombinant AAV， rAAV），其是在設計AAV載體基因組時，將編碼區(qū)基因序列替換為目的基因和相關(guān)功能片段，僅保留兩端反向末端重復序列，在質(zhì)粒中表達包裝病毒，然后直接使用 rAAV 感染細胞。病毒編碼序列的完全去除一方面可以最大化重組 AAV 攜帶轉(zhuǎn)基因的容量，另一方面可減小在體內(nèi)遞送時的免疫原性和細胞毒性。這也就是我們所說的AAV載體。

rAAV生產(chǎn)-三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法

rAAV在生產(chǎn)時多采用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法。具體制備流程為，首先構(gòu)建并純化獲得三個質(zhì)粒：

1）順式載體質(zhì)粒編碼AAV反向末端重復序列和目的基因；

2）反式質(zhì)粒編碼AAV的rep和cap基因；

3）輔助質(zhì)粒通常編碼腺病毒的輔助基因。然后將三個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染合適的細胞株，就能在細胞裂解液中得到攜帶目的基因的rAAV。這種制備方法需要制備大量高質(zhì)量的載體質(zhì)粒，rAAV的產(chǎn)量在很大程度上取決于轉(zhuǎn)染的效率。

選擇合適的rAAV血清型

綜合以上，用一句話簡單的概括：rAAV與AAV的區(qū)別在于內(nèi)部基因不同，外殼相同。由于AAV根據(jù)不同的衣殼蛋白有不同的血清型，所以rAAV作為基因治療的遞送載體也有不同血清型。目前文獻中使用最多的 rAAV 血清型包括 2、5、8、9。這幾種血清型基本涵蓋了大部分組織和臟器的特異性感染。

不同血清型AAV載體對比

rAAV轉(zhuǎn)導途徑

得到rAAV之后，它又是怎么進入細胞并發(fā)揮作用的？rAAV轉(zhuǎn)導細胞主要有識別細胞表面受體、內(nèi)吞、逃離內(nèi)體、入核、脫衣殼、雙鏈轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)錄和翻譯幾個過程。如下圖所示，具體每一步為：

1） rAAV被靶細胞表面糖基化修飾的受體識別；

2）通過網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞作用進入細胞，包裹于早期內(nèi)體中；

3）rAAV在細胞骨架蛋白網(wǎng)絡的幫助下由細胞胞漿向細胞核運輸；

4）在內(nèi)體的酸性環(huán)境下，rAAV的衣殼蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，暴露出VP1和VP2的N末端，rAAV病毒粒子從晚期內(nèi)體中釋放出來；

5）逃離內(nèi)體后的rAAV或者由蛋白酶體進行蛋白降解，或者進入細胞核；

6）rAAV病毒粒子一旦進入細胞核，就會脫殼并釋放其單鏈基因組，并復制形成雙鏈DNA (dsDNA)模板；

7）在雙鏈DNA模板上進行轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯為治療性蛋白質(zhì)。

相信介紹到這，對于開頭的問題大家都有了答案。最后讓我們再一起來總結(jié)一下rAAV作為基因治療載體的優(yōu)勢有哪些。

rAAV載體優(yōu)勢

安全性高：目前還沒有發(fā)現(xiàn) AAV 對人體致??；每 10 個人中就有 8 個人在一生中會感染 AAV，而 rAAV 更是去除了 96% 的 AAV 基因組，進一步確保了安全性。
免疫原性低：當用AAV 局部大劑量感染肌肉、腦、眼等組織時，很少有感染上的細胞之后被免疫系統(tǒng)所清除。這種特性對于動物實驗上顯然極有幫助。
宿主范圍廣：幾乎所有處于分裂期和靜止期的細胞都可以使用 AAV 來感染。
表達時間長：rAAV 可在宿主細胞中形成附加體（episome）存在于細胞核中，在細胞分裂不旺盛的組織中可持續(xù)表達 5 個月以上。
擴散性強：rAAV 具有遠高于腺病毒和慢病毒的擴散性，可以穿透血腦屏障，是最理想的神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞感染工具。
特異性強：rAAV 有數(shù)十種常用的血清型，不同的血清型對不同的臟器有較高的識別及感染能力。

結(jié)語

近年來基因治療研究越來越火熱，已經(jīng)成為全球最具發(fā)展?jié)摿Φ尼t(yī)藥領(lǐng)域之一。作為一種革命性的治療手段，具有“一次注射，終生治愈”的潛力，給諸多難治性疾病患者帶來了曙光。另外隨著AAV遞送系統(tǒng)不斷成熟，基因治療已逐步走向快速發(fā)展的黃金賽道。

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