近年來，基因治療方法的快速進(jìn)展使現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)生了顯著轉(zhuǎn)變。通過應(yīng)用先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)和增強(qiáng)的遞送系統(tǒng)，個體化基因精準(zhǔn)藥物治療時代已經(jīng)到來。其中一個引人注目的突破是在全球抗擊SARS-CoV-2大流行中，兩種mRNA疫苗的非凡成功，開啟了無數(shù)可能性的大門，激發(fā)了對一系列以前無法治療的人類疾病進(jìn)行創(chuàng)新RNA治療的探索。

mRNA有助于將遺傳信息從DNA傳遞到核糖體--細(xì)胞生物合成的大分子機(jī)器。為了準(zhǔn)確解讀嵌入在mRNA中的遺傳信息，核糖體需要得到轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）的幫助。tRNA經(jīng)典上被認(rèn)為是基因密碼的解析者，通過mRNA密碼子與相應(yīng)tRNA的反密碼子的互補(bǔ)堿基配對，將核酸身份轉(zhuǎn)化為氨基酸。mRNA中的四個核苷酸形成了64個獨(dú)特的三聯(lián)體（密碼子）。其中61個是有義密碼子，3個終止密碼子。有些基因突變會將61個有義密碼子中的18個轉(zhuǎn)化為終止密碼子，導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯的過早終止和失去功能的疾病表型的發(fā)展。這些突變占據(jù)了遺傳疾病的約11%，成為整個人類群體中引起疾病的主要突變類型之一。而tRNA療法可以通過補(bǔ)充已受到影響的tRNA來抵消突變的影響，從而恢復(fù)蛋白質(zhì)合成和功能。

但tRNA作為治療藥物面臨著許多挑戰(zhàn)，如低效性、不穩(wěn)定性、免疫原性和安全性問題，這些挑戰(zhàn)阻礙了它們的臨床應(yīng)用。然而，過去三十年來mRNA和小RNA治療方面的技術(shù)突破已經(jīng)開始解決了許多這些挑戰(zhàn)，包括通過使用修飾核苷酸來增強(qiáng)穩(wěn)定性和降低免疫原性，以及開發(fā)各種材料來有效地封裝和遞送RNA。這些技術(shù)突破同樣適用于tRNA治療，并重新引起了科學(xué)界和產(chǎn)業(yè)界對于利用tRNA作為創(chuàng)新基因治療方法治療單基因疾病的興趣。

本文將簡要介紹利用tRNA作為治療藥物治療單基因疾病的關(guān)鍵策略，并評估最近發(fā)展的用于系統(tǒng)和特異性遞送tRNA的遞送平臺。

半個世紀(jì)以前，三項(xiàng)重要的研究為tRNA基因治療奠定了基礎(chǔ)（圖1）。Sveda等人將預(yù)先裝載異源天然sup-tRNA（大腸桿菌或酵母）的紅細(xì)胞與表達(dá)截短的次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）的小鼠細(xì)胞融合，恢復(fù)了完整長度的蛋白質(zhì)表達(dá)。Kan等人將天然酵母sup-tRNASer加入從β-地中海貧血患者中得到的紅細(xì)胞溶液，該患者的β-珠蛋白基因在賴氨酸AAG密碼子處有一個無義突變，成功地修復(fù)了最多10%的完整長度β-珠蛋白。

圖1. tRNA療法的關(guān)鍵里程碑

為了擴(kuò)大sup-tRNA在不同組織和疾病背景下的應(yīng)用，人們采用了兩種途徑進(jìn)行sup-tRNA補(bǔ)充：（1）作為質(zhì)粒編碼的sup-tRNA基因，在細(xì)胞核中進(jìn)行外顯子表達(dá)；（2）將體外轉(zhuǎn)錄（IVT）的sup-tRNA轉(zhuǎn)染到接受細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。然而，這些sup-tRNA在臨床相關(guān)模型系統(tǒng)中的活性低效，即使在較高劑量下進(jìn)行多基因拷貝補(bǔ)充，以及臨床應(yīng)用的早期階段的遞送平臺的開發(fā)，都阻礙了臨床進(jìn)展。

過去十年見證了將tRNA與病理相關(guān)的異常聯(lián)系起來的新的機(jī)制性發(fā)現(xiàn)，并提出了tRNA作為一種新的治療方式。兩項(xiàng)最近的研究表明，在預(yù)臨床實(shí)驗(yàn)中使用AAV或LNPs遞送tRNA，可以獲得很好的治療效果。

未來，開發(fā)更多的RNA基因治療遞送系統(tǒng)，將會促進(jìn)tRNA-based therapy在治療其他疾病方面的應(yīng)用。

有兩類單基因疾病可能可以通過tRNA基因治療來解決：（1）與無義突變相關(guān)的疾?。?）與tRNA耗竭相關(guān)的AARS突變相關(guān)的疾?。▓D2）。

圖2. 基于tRNA的治療方式

• 利用sup-tRNAs進(jìn)行矯正治療

無義突變是一種常見的疾病相關(guān)突變類型，它引入了早停密碼子（PTC），導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成過程中的終止。為了抑制與無義突變相關(guān)的PTC，并引入正確的氨基酸，需要使用19種sup-tRNA（圖3）。這些sup-tRNA具有足夠的活性，可以在翻譯過程中支持所需蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，以達(dá)到治療所需的閾值。

圖3. 人群中與各種遺傳病相關(guān)的無義突變頻率

sup-tRNA的一個顯著優(yōu)勢是，單個治療制劑可以用于治療多種與無義突變相關(guān)的疾病。例如，最常見的無義突變是將精氨酸CGA密碼子突變?yōu)閁GA PTC。因此，一種強(qiáng)效的sup-tRNA可以用于治療與精氨酸密碼子相關(guān)的各種疾病中的無義突變。然而，序列上下文驅(qū)動的讀過效率變化和組織特異性遞送的差異是需要解決的障礙。

sup-tRNA僅作用于受影響基因的自然轉(zhuǎn)錄本庫，這消除了過表達(dá)的風(fēng)險(xiǎn)。因此，sup-tRNA非常適合治療與基因中的無義突變相關(guān)的疾病，這些基因需要精確調(diào)節(jié)。一個例子是MeCP2基因，該基因是一個眾所周知的Goldilocks基因。缺乏MeCP2導(dǎo)致Rett綜合征，而MeCP2的過度表達(dá)導(dǎo)致MECP2復(fù)制綜合征。

在某些情況下，由于tRNA的進(jìn)化年齡和選擇性，工程改造可能無法使其抵抗解碼PTC，或者抑制的效力可能不足以獲得治療效果。在這種情況下，可以使用攜帶不同氨基酸的強(qiáng)效sup-tRNA來恢復(fù)PTC的翻譯。這種策略模仿了錯義突變，可能適用于特定的蛋白質(zhì)。例如，與杜氏肌營養(yǎng)不良相關(guān)的肌營養(yǎng)素基因可以容忍錯義突變，而Dravet綜合征或囊性纖維化中的疾病相關(guān)蛋白對錯義突變敏感。將sup-tRNA與經(jīng)過批準(zhǔn)的治療方法相結(jié)合，可以減輕由sup-tRNA引起的錯誤插入氨基酸的錯誤折疊效應(yīng)。

• tRNA補(bǔ)充療法

根據(jù)最近的研究，一些與不同病理學(xué)相關(guān)的疾病共享了tRNA同義密碼子家族的短暫或永久耗竭的特征。這種耗竭會導(dǎo)致受影響密碼子的翻譯異常。例如，與幾個AARS基因中的雜合突變相關(guān)的Charcot-Marie-Tooth (CMT)病理學(xué)就是一個典型例子。這種病理學(xué)的特征是長度依賴性軸突萎縮和退化。

在大多數(shù)情況下，AARS基因的突變不會改變酶的氨酰化活性，這表明酶活性的喪失并不是導(dǎo)致疾病的必要條件。最近的研究發(fā)現(xiàn)，CMT相關(guān)的甘氨酸-tRNA合成酶突變引起了tRNAsGly釋放動力學(xué)的改變。這種短暫的tRNAsGly固定顯著降低了所有四個甘氨酸密碼子的翻譯速度，改變了含甘氨酸的轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)，并激活了整合應(yīng)激反應(yīng)。

在CMT小鼠中增加最豐富的tRNAGly(GCC)的拷貝數(shù)減輕了萎縮和退化，這表明補(bǔ)充相應(yīng)的tRNA可能是一種合適的治療策略。增加主要tRNA同義密碼子的水平足以克服突變的甘氨酸-tRNA合成酶引起的tRNA固定。然而，更有利的做法是使用包括所有由突變AARS充電的相應(yīng)tRNA同義密碼子的混合物，其比例模擬其自然濃度。這將確保在所有甘氨酸密碼子上恢復(fù)翻譯功能的整體平衡和更好的療效。

為了充分發(fā)揮tRNA在單基因疾病精準(zhǔn)治療中的潛力，需要開發(fā)和定制與tRNA荷載相關(guān)的特定限制的制劑策略。tRNA具有負(fù)電荷且容易受到降解，使其進(jìn)入細(xì)胞變得困難。因此，實(shí)現(xiàn)對特定組織或細(xì)胞類型的高效遞送是確保tRNA基因治療臨床有效性的關(guān)鍵。

在病毒和非病毒遞送系統(tǒng)領(lǐng)域已經(jīng)取得了顯著進(jìn)展，為遞送不同RNA荷載和靶向不同組織提供了可行的選擇。盡管tRNA作為治療藥物的潛力直到最近才被認(rèn)識到，并且尚未進(jìn)行任何臨床研究，但最近的研究表明使用為其他RNA開發(fā)的遞送平臺可以成功給藥sup-tRNA，從而支持了tRNA治療藥物的潛在適用性。

為了設(shè)計(jì)臨床相關(guān)的藥物遞送載體以輸送tRNA，考慮到作用機(jī)制和相應(yīng)病理的組織起始點(diǎn)是非常重要的。病毒衍生的載體或外泌體對穿越血腦屏障（BBB）具有天然的趨性（圖4），對于治療中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)作為主要起始組織的疾病非常有吸引力。合成載體（如脂質(zhì)體和生物相容性聚合物）可能更適合于重復(fù)的全身給藥，并為對AAV載體不可及的組織提供了一種補(bǔ)充選擇（如腎臟和肺部）。

圖4. 治療性tRNA遞送方法

生物相容的聚氧氯丙胺共聚物最近有望替代LNPs或AAV作為tRNA的載體。利用聚氧乙烯的低免疫原性和良好的安全性，已經(jīng)開發(fā)出一種用于將質(zhì)粒DNA載荷遞送到肺部的自組裝顆粒。該系統(tǒng)包含三種合成肽，一個錨定肽具有來自聚氧乙烯的疏水區(qū)塊，一個陽離子部分含有堿性氨基酸用于封裝核酸并促進(jìn)內(nèi)體逃逸，以及一個靶向區(qū)塊用于將顆粒靶向特定組織。這些顆粒在體外、細(xì)胞模型和小鼠模型中進(jìn)行了測試，用于囊性纖維化的mRNA替代療法。

tRNA治療是一種新興的治療方法，其潛力和前景備受期待。目前，所有tRNA治療平臺仍處于發(fā)現(xiàn)階段或臨床前開發(fā)階段，但已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展（圖5）。隨著tRNA治療的研究不斷深入，進(jìn)行tRNA治療的臨床試驗(yàn)已經(jīng)成為必然趨勢。

圖5. tRNA的潛在應(yīng)用總結(jié)

進(jìn)行使用tRNA治療的臨床試驗(yàn)需要考慮安全性、有效性和符合監(jiān)管要求。臨床前研究對于建立tRNA治療的藥理學(xué)和毒理學(xué)特性至關(guān)重要。這些研究需要全面評估tRNA分子的生物分布、代謝和潛在的不良反應(yīng)，為臨床試驗(yàn)提供安全性和有效性的支持。

對于罕見疾病的臨床試驗(yàn)面臨的挑戰(zhàn)是患有相同疾病指征的患者人數(shù)較少，考慮到特定的突變特征，這一數(shù)量甚至更少。因此，適合使用tRNA治療的疾病需要獨(dú)特的臨床試驗(yàn)方法。在這方面，已經(jīng)應(yīng)用于癌癥精確治療的basket trials可能適用于tRNA治療。對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙等導(dǎo)致共同癥狀的疾病，如Dravet綜合征、Rett綜合征、CDKL5缺陷和Angelman綜合征，可能適合使用共同制劑的basket trials。通過這種方式，可以觸及更大規(guī)模的患者群體。

確定對照組可能困難，因?yàn)檎谘芯康亩喾N疾病的癥狀異質(zhì)性。因此，進(jìn)行無安慰劑對照組的單臂basket trials可能更為合適。臨床試驗(yàn)在確定劑量方案和長期安全性和有效性方面起著至關(guān)重要的作用，需通過在長時間內(nèi)（>15年）進(jìn)行監(jiān)測，并建立終身監(jiān)測體系。

外源tRNA分子的潛在免疫原性和免疫反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)必須進(jìn)行仔細(xì)評估。應(yīng)建立可量化的疾病生物標(biāo)志物以及在生物樣本中定量和表征tRNA分子的可靠方法，以確保在臨床試驗(yàn)期間進(jìn)行準(zhǔn)確的分析和比較。重要的是，在整個試驗(yàn)過程中與監(jiān)管機(jī)構(gòu)密切合作并遵守倫理指南，以確保tRNA治療的安全性和可靠性。

通過解決這些問題，涉及tRNA治療的臨床試驗(yàn)可以為其安全性和有效性提供寶貴的見解，為最終批準(zhǔn)和將其納入臨床實(shí)踐鋪平道路。

tRNA療法是一種具有治療各種疾病潛力的新型基因治療方法。目前，大部分研究還處于臨床前階段，但已經(jīng)有幾家公司在探索tRNA的治療潛力。盡管距離第一個tRNA治療獲得臨床試驗(yàn)批準(zhǔn)可能還需要幾年時間，但隨著tRNA生物學(xué)和設(shè)計(jì)、核苷酸化學(xué)、遞送系統(tǒng)和生物信息學(xué)的不斷突破，基于tRNA的基因治療正在形成。這個已有半個多世紀(jì)歷史的tRNA治療概念可能很快進(jìn)入一個新的領(lǐng)域，用于作為單基因疾病的新型治療模式。

參考資料

1.tRNA therapeutics for genetic diseases.

2.Emerging roles of tRNA in adaptive translation, signalling dynamics and disease.

3.The expanding world of tRNA modifications and their disease relevance.

來源 | 生物制藥小編

發(fā)布時間 | 2023年12月13日

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