突破！人工智能賦能干細(xì)胞技術(shù)，中國科學(xué)家創(chuàng)造了一個(gè)“首次”

多能干細(xì)胞（如iPS細(xì)胞）可分化為多種類型的功能性細(xì)胞（如心肌細(xì)胞、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元等），這些功能性細(xì)胞為再生醫(yī)學(xué)、發(fā)育和疾病體外建模以及藥物篩選評估提供了無限的細(xì)胞來源，推動著再生醫(yī)學(xué)的臨床應(yīng)用發(fā)展。例如，使用多能干細(xì)胞來源的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞有望治療黃斑變性、使用胰島細(xì)胞有望治療糖尿病等。

然而，目前多能干細(xì)胞的定向分化效率仍存在細(xì)胞系間和批次間的不穩(wěn)定的問題，嚴(yán)重阻礙了多能干細(xì)胞臨床應(yīng)用產(chǎn)品的研發(fā)進(jìn)程及規(guī)?；圃臁Ｒ虼?，如何實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞分化過程的實(shí)時(shí)質(zhì)控和監(jiān)控進(jìn)而對多能干細(xì)胞的分化時(shí)間、誘導(dǎo)因子、分化軌跡等進(jìn)行全自動化的動態(tài)調(diào)整，有效降低不同批次之間的多能干細(xì)胞產(chǎn)品的穩(wěn)定性，是干細(xì)胞技術(shù)轉(zhuǎn)化應(yīng)用的關(guān)鍵問題。

在多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中，由于走向不同分化的細(xì)胞通常會伴隨著其特征性的形態(tài)變化，研究人員往往會根據(jù)經(jīng)驗(yàn)及時(shí)調(diào)整實(shí)驗(yàn)方案，來降低多能干細(xì)胞定向分化的不穩(wěn)定性。但這些經(jīng)驗(yàn)往往難以量化和復(fù)制，細(xì)胞圖像中快速或細(xì)微的變化也難以被人眼捕捉到。隨著活細(xì)胞顯微成像技術(shù)的成熟和機(jī)器學(xué)習(xí)方法的快速發(fā)展，多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中這些特定的細(xì)胞類型和狀態(tài)可被有效識別和標(biāo)記，使得基于成像技術(shù)的機(jī)器學(xué)習(xí)，人工智能的全自動輔助系統(tǒng)開發(fā)成為可能。

來源：Cell Discovery

6月6日，北京大學(xué)趙揚(yáng)課題組及張玨研究組、北京交通大學(xué)劉一研究組合作在Cell Discovery雜志（IF=38）在線發(fā)表論文。此研究首先以多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化為例，利用活細(xì)胞成像技術(shù)（通過蔡司Cell Discover 7成像系統(tǒng)實(shí)時(shí)采集細(xì)胞分化過程中的圖像）與機(jī)器學(xué)習(xí)方法，成功實(shí)現(xiàn)了：

1. 非侵入式地對多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞的不同階段的誘導(dǎo)效率的實(shí)時(shí)預(yù)測；

2. 對分化時(shí)間和誘導(dǎo)因子濃度進(jìn)行實(shí)時(shí)判斷，有效調(diào)控和干預(yù)了多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的效率；

3. 建立了基于細(xì)胞圖像的機(jī)器學(xué)習(xí)算法，且成功應(yīng)用于多能干細(xì)胞在心肌細(xì)胞分化中間態(tài)細(xì)胞的純化；

4. 利用細(xì)胞圖像機(jī)器學(xué)習(xí)算法，也為小分子篩選提供檢測指標(biāo)，可對細(xì)胞分化的“抗擾能力”進(jìn)行有效優(yōu)化（圖1）。

圖1. 基于圖像機(jī)器學(xué)習(xí)的穩(wěn)定優(yōu)化心肌分化體系的策略總流程

經(jīng)驗(yàn)證，這套方法和流程還可以用于多能干細(xì)胞向肝、腎等前體細(xì)胞分化，有效優(yōu)化及改進(jìn)了分化體系。這些發(fā)現(xiàn)有望為促進(jìn)高質(zhì)量多能干細(xì)胞產(chǎn)品在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域里的臨床研究及規(guī)?；a(chǎn)提供重要技術(shù)基礎(chǔ)。

具體來說，該研究實(shí)現(xiàn)了以下4大功能：

功能1：基于機(jī)器學(xué)習(xí)對心肌細(xì)胞和心肌祖細(xì)胞進(jìn)行識別和純化

該研究以多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化體系為主要示例，收集分化全過程明場圖像流和最終cTnT（一種心肌細(xì)胞的特異標(biāo)志物）免疫熒光染色結(jié)果。在終末分化的心肌階段（分化第12天），成功分化的心肌細(xì)胞具有明顯形態(tài)特征（圖2）。通過pix2pix深度學(xué)習(xí)模型，研究者利用心肌細(xì)胞誘導(dǎo)階段的明場圖像預(yù)測cTnT熒光陽性區(qū)域，成功實(shí)現(xiàn)了僅通過細(xì)胞明場圖像直接進(jìn)行跨細(xì)胞系、跨批次的心肌細(xì)胞識別和分化效率的評估。預(yù)測的分化效率與真實(shí)分化效率之間的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.93。隨后，研究者通過對圖像流的回溯，發(fā)現(xiàn)最終能成功分化為心肌的細(xì)胞在心臟祖細(xì)胞階段（分化第6天），其明場圖像就已具備紋理特征。利用基于Grad-CAM的弱監(jiān)督分割方法，機(jī)器學(xué)習(xí)模型成功識別了這群心肌祖細(xì)胞，它們被命名為“圖像識別的心肌祖細(xì)胞（Image-Recognized CPC，IR-CPC）”。機(jī)器學(xué)習(xí)預(yù)測的IR-CPC比例和最終真實(shí)分化效率相關(guān)系數(shù)達(dá)0.88。以上研究結(jié)果表明，無論從心肌分化最終的分化效率還是心肌分化的中間階段的分化效率，機(jī)器學(xué)習(xí)都可以準(zhǔn)確的進(jìn)行預(yù)測，可以提前識別出位于正確分化軌跡的細(xì)胞（圖3）。

圖2. 心肌細(xì)胞分化全程的圖像流

圖3. 心肌細(xì)胞與心肌祖細(xì)胞的識別與純化

在此基礎(chǔ)上，研究者基于機(jī)器學(xué)習(xí)對心肌祖細(xì)胞區(qū)域的預(yù)測和光激活探針DACT-1，對非目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行了熒光標(biāo)記，并使用流式細(xì)胞分選有效純化了目標(biāo)細(xì)胞產(chǎn)物。利用純化的心臟祖細(xì)胞繼續(xù)分化，可獲得純度高達(dá)94.7%的心肌細(xì)胞，相較于未純化組的純度63.0%有顯著提高。這一體系在沒有生物標(biāo)志物的情況下，實(shí)現(xiàn)了分化過程中目標(biāo)細(xì)胞產(chǎn)物（心肌祖細(xì)胞）的實(shí)時(shí)分離純化，有助于減少雜細(xì)胞污染，確保分化中間階段的純度和效率（圖3）。

功能2：基于機(jī)器學(xué)習(xí)實(shí)時(shí)評估調(diào)整心肌分化早期誘導(dǎo)物CHIR99021的劑量

通過進(jìn)一步回溯正確分化軌跡細(xì)胞的早期細(xì)胞形態(tài)動態(tài)特征，研究者發(fā)現(xiàn)中胚層階段（0~3天）使用的小分子誘導(dǎo)物CHIR99021（CHIR）的劑量（濃度與處理時(shí)間）對心肌分化效率至關(guān)重要，其劑量稍高或稍低就會導(dǎo)致分化失敗。研究者同時(shí)發(fā)現(xiàn)最佳的濃度和處理時(shí)間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，這意味著如果能在早期將不合適的劑量條件識別出來，將有可能幫助及時(shí)扭轉(zhuǎn)錯(cuò)誤的分化軌跡。

研究者使用邏輯回歸模型，僅依靠分化初期0~12h明場圖像流的特征評估CHIR劑量條件的合適程度。選定CHIR處理時(shí)間后，機(jī)器學(xué)習(xí)模型能對每個(gè)孔所用的CHIR濃度進(jìn)行“偏低”、“適中”、“偏高”的判斷，準(zhǔn)確率可達(dá)93.1%。隨后，研究者驗(yàn)證了在預(yù)測CHIR濃度不合適的情況下，及時(shí)調(diào)整CHIR處理時(shí)間和濃度確實(shí)能夠糾正錯(cuò)誤分化細(xì)胞的軌跡并提高心肌分化效率，這有助于維持心肌細(xì)胞分化的高效進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)對每批多能干細(xì)胞分化條件的實(shí)時(shí)控制和及時(shí)糾錯(cuò)（圖4）。

圖4. 實(shí)時(shí)評估調(diào)整分化早期誘導(dǎo)物CHIR的劑量

功能3：基于機(jī)器學(xué)習(xí)模型實(shí)時(shí)判斷多能干細(xì)胞起始分化的最佳狀態(tài)

盡管機(jī)器學(xué)習(xí)模型能幫助研究者選擇最佳的CHIR劑量，但研究者觀察發(fā)現(xiàn)，即使在最佳的CHIR劑量下，細(xì)胞的分化仍然存在異質(zhì)性，即仍然存在分化失敗的細(xì)胞。通過追蹤心肌分化全程的明場圖像流，研究者發(fā)現(xiàn)多能干細(xì)胞的分化潛力存在空間異質(zhì)性：分化第0天處于多能干細(xì)胞克隆邊緣的細(xì)胞更容易分化成功，而位于多能干細(xì)胞克隆中心的細(xì)胞易分化失敗。為了分析克隆形態(tài)和最終分化效率之間的關(guān)系，研究者提取了開始分化前多能干細(xì)胞克隆的圖像特征，并建立了基于隨機(jī)森林的機(jī)器學(xué)習(xí)模型，以識別最有利于分化的起始細(xì)胞圖像特征。

這一模型可以實(shí)現(xiàn)在最佳CHIR劑量條件下，僅根據(jù)多能干細(xì)胞克隆狀態(tài)成功預(yù)測多能干細(xì)胞的分化效果，其相關(guān)性達(dá)0.76。這一模型有望用于實(shí)時(shí)最終克隆形態(tài)，利用機(jī)器學(xué)習(xí)模型來判斷最佳的分化起始時(shí)間。此外，通過對圖像特征重要程度的分析，研究者發(fā)現(xiàn)克隆面積合適且邊緣越長、越崎嶇，越有利于分化。這啟發(fā)研究者把目光轉(zhuǎn)向細(xì)胞的傳代操作，并發(fā)現(xiàn)通過調(diào)整實(shí)驗(yàn)操作，在相同起始細(xì)胞數(shù)的情況下盡可能地將每個(gè)細(xì)胞克隆的面積減小，也能有效提高心肌分化效率?？傊芯空咄ㄟ^對明場圖像流的觀察和機(jī)器學(xué)習(xí)，鎖定關(guān)鍵圖像特征，指導(dǎo)分化開始的最佳時(shí)機(jī)，實(shí)現(xiàn)了對分化起始多能干細(xì)胞狀態(tài)的實(shí)時(shí)質(zhì)控并進(jìn)一步優(yōu)化了分化體系（圖5）。

圖5. 調(diào)控優(yōu)化多能干細(xì)胞分化的起始狀態(tài)

功能4：基于細(xì)胞圖像的機(jī)器學(xué)習(xí)開展小分子篩選，提高心肌分化體系穩(wěn)定性

研究者發(fā)現(xiàn)，在分化早期CHIR劑量偏高情況下，多能干細(xì)胞錯(cuò)誤的向體節(jié)中胚層分化，而劑量不足的情況向內(nèi)胚層分化，因而誘導(dǎo)心臟中胚層的CHIR劑量窗口較窄，這可能是心肌細(xì)胞分化批次不穩(wěn)定的主要原因之一。因此，研究者以心肌分化第6天圖像結(jié)合已建立的弱監(jiān)督模型作為小分子篩選評價(jià)手段，構(gòu)建了小分子篩選平臺，并對3000多個(gè)小分子進(jìn)行篩選以發(fā)現(xiàn)抑制體節(jié)中胚層細(xì)胞命運(yùn)的小分子（確保CHIR高劑量仍然向心肌中胚層分化）。最終，研究者發(fā)現(xiàn)化合物BI-1347（一種CDK8抑制劑）可大幅拓寬分化早期CHIR濃度的適用范圍，增加分化體系對CHIR過高濃度的容忍度，顯著提高批次間與細(xì)胞系間的分化穩(wěn)定性。RNA-seq結(jié)果顯示，BI-1347的加入使細(xì)胞在CHIR高劑量條件下仍向心肌中胚層分化，且各類功能鑒定結(jié)果顯示是否加入BI-1347對分化的心肌細(xì)胞質(zhì)量和亞型比例無影響。總之，研究者基于機(jī)器學(xué)習(xí)的細(xì)胞識別模型建立了一個(gè)具有早期準(zhǔn)確評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的高通量篩選平臺，縮短了篩選實(shí)驗(yàn)周期，降低了篩選成本；通過這一技術(shù)篩選到的小分子通過提升心肌分化體系對CHIR高劑量的耐受度，從而拓寬了CHIR劑量可應(yīng)用的范圍，顯著提升了分化體系在不同細(xì)胞系和不同批次之間的穩(wěn)定性（圖6）。

圖6. 小分子篩選發(fā)現(xiàn)化合物BI-1347有效拓寬CHIR劑量的有效范圍

綜上所述，針對多能干細(xì)胞向功能性細(xì)胞分化不穩(wěn)定的問題，這一研究開發(fā)了一種非侵入式的、基于細(xì)胞明場動態(tài)圖像和機(jī)器學(xué)習(xí)的策略，實(shí)時(shí)智能地調(diào)節(jié)和優(yōu)化分化過程，實(shí)現(xiàn)跨細(xì)胞系和批次的持續(xù)高效分化，為多能干細(xì)胞定向分化功能性細(xì)胞的高效、穩(wěn)定生產(chǎn)提供了解決方案。最后，為拓展分化策略的應(yīng)用場景，研究者在腎祖細(xì)胞分化和肝細(xì)胞分化早期分別采用以上策略，取得了準(zhǔn)確預(yù)測效果，這能為分化提供實(shí)時(shí)的指導(dǎo)。該技術(shù)有望未來進(jìn)一步發(fā)展成為基于人工智能的封閉式干細(xì)胞分化系統(tǒng)，并為建立基于細(xì)胞明場圖像的“經(jīng)驗(yàn)分享”平臺提供技術(shù)支持。

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本文章來源于醫(yī)藥魔方

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突破！人工智能賦能干細(xì)胞技術(shù)，中國科學(xué)家創(chuàng)造了一個(gè)“首次”

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