一、物理滴度

1、病毒顆粒滴度

病毒顆粒滴度又稱為衣殼滴度，是以AAV顆粒數(shù)作為計量單位，測定的是AAV顆粒濃度，可分為實心AAV顆粒滴度、空心AAV顆粒滴度和AAV顆粒總滴度等。AAV工藝中較高的空殼率一直是AAV工藝面臨的主要挑戰(zhàn)之一，野生型AAV的空殼率一般在50%以上，AAV工藝采用的基因組序列缺失了部分包裝相關的順式元件，其空殼率相對更高。目前監(jiān)測病毒顆粒滴度或顆粒滴度比值的方法較多，例如酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-LinkedImmunoSorbent Assay, ELISA）、透射電鏡（Transmissionelectron microscopes, TEM）、高效液相色譜（High-performanceliquid chromatography, HPLC）、分析型超速離心技術（AnalyticalUltraCentrifugation,AUC）等，其中TEM與AUC一般只用來檢測AAV制品中空殼AAV顆粒滴度與實心AAV顆粒滴度的比值。

（1）ELISA

ELISA通過與AAV衣殼特異性結合抗體上連接的酶催化底物反應顯色來測定AAV顆粒滴度。最常見的為抗體夾心ELISA法，先將捕獲抗體固定在ELISA板上，用于特異性結合AAV顆粒，然后被捕獲的AAV顆粒通過和檢測抗體結合并加入底物實現(xiàn)酶促顯色反應進行定量。目前基于ELISA法的針對多種血清型抗原表位的特異性單克隆抗體已經實現(xiàn)商業(yè)化應用。該方法通常用于純化后的AAV，優(yōu)點是重現(xiàn)性和特異性較好，但操作步驟較為繁瑣，實驗周期一般較長。鑒于上述缺點，研發(fā)人員將其轉移到成熟的Gyrolab 系統(tǒng)（GyrosProtein Technologies. Gyrolab ImmunoassaySystems?.2020.），開發(fā)了一種基于自動化微流體平臺的小型化ELISA，有望縮短實驗周期并將檢測通量提高到每小時96個樣本，同時將線性范圍提高一個數(shù)量級。此外，無法區(qū)分完整的實心AAV顆粒與空殼顆粒是ELISA法的一大遺憾。

（2）TEM

AAV顆粒直徑約為20~26nm，可通過透射電鏡較為直觀的觀察其外觀，通過直接計數(shù)來定量AAV顆粒，但是用于電子顯微技術的樣品制備容易產生偽影，一般不用來計算絕對滴度。但在檢測病毒空殼含量與實心病毒顆粒含量比值方面，這種方法較為經典。相對包裝了基因組的AAV顆粒，由于未包裝了基因組DNA的病毒顆粒中間密度低，在電鏡下顆粒圖像中部會出現(xiàn)空洞（黑點），而含基因組病毒顆粒為實心。但偶爾由于樣本染色操作過程的差異，可能導致一定誤判，此外，一部分AAV包裝進去的基因組不完整，介于空殼顆粒與實心顆粒之間，也為準確定量實心顆粒滴度帶來一定困難。盡管有報道TEM可用于未純化的樣品，但它通常被用于純化樣品，因為細胞裂解物中存在的蛋白質和細胞碎片等雜質會干擾對TEM圖像中AAV衣殼的準確識別。

（3）HPLC

HPLC是一種快速方便的分析技術，以液體作為其流動相，采用高壓注液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，在化學產品定量分析中很常見，也可用于定量分析AAV，能夠區(qū)分AAV制品中空衣殼和完整衣殼的含量，且可應用于各種血清型AAV定量檢測，檢測通量高，可應用于AAV工藝中即時檢測。尺寸排阻色譜與18角度激光光散射檢測器聯(lián)用技術（SEC-MALS）目前已被較為廣泛的應用于生物制品的工藝過程中，是一種功能強大的分析工具。一次進樣，15-30min即可精確定量AAV制品的多個關鍵質量屬性指標：滴度、總蛋白濃度（Cp）、純度/聚集體比例等與傳統(tǒng)方法相比，具有高效、快速、準確度高等優(yōu)點。

（4）AUC

AUC技術主要是為了研究生物大分子的沉降特性和結構，而不是專門收集某一特定組份。因此它使用了特殊的轉子和檢測手段，以便連續(xù)監(jiān)視物質在一個離心場中的沉降過程。通過紫外線吸收或者Raleigh干擾，實時掃描檢測離心過程中樣本中各個組分隨著時間其沉降剖面分布狀態(tài)的變化過程，計算出各個組分的沉降系數(shù)。根據空殼AAV和實心AAV沉降系數(shù)差異，可準確定量空殼AAV滴度和含完整基因組的實心AAV滴度的比值。

AUC在定量不同顆粒滴度比方面具有重復性高（變異系數(shù)僅為2%）且能夠有效區(qū)分完整衣殼與空衣殼顆粒。AUC分析法的缺點是只能檢測純化的AAV制品，且檢測樣品用量較大。此外AUC檢測周期較長，約為6小時，一次僅能分析3~7個樣本，實驗通量低。

上述幾種檢測AAV顆粒滴度或不同顆粒滴度比值的方法，在準確度、靈敏性及實驗周期等方面各有優(yōu)缺點，往往需要多種方法互相輔助、相互印證。

2、基因組滴度

基因組滴度以AAV衣殼中所含基因組含量作為定量依據，測定的是含目標基因組的AAV濃度。AAV中包含的基因組是其表達蛋白或RNA的前提，是AAV藥物發(fā)揮藥效的核心或基礎，若AAV中不含基因組，藥物不僅沒有藥效，反而會增加機體針對AAV藥物的免疫反應?；蚪M滴度理論上應該與生物學滴度（感染滴度或轉導滴度）呈線性關系。

基因組滴度測定目前有PCR法、點雜交法（Dot-blot）和分光光度法等。無論哪種方法，首先需要將AAV顆粒外部的DNA成分用DNaseI徹底消化去除，否則會影響定量準確性，使基因組滴度測定偏高。

（1）點雜交法

點雜交法是一種較為早期的定量方法，將靶標DNA吸附結合到硝酸纖維膜或尼龍膜上，后采用標記的特異性探針與AAV基因組DNA片段雜交結合，之后通過熒光或顯色的方式定量AAV基因組滴度。由于雜交溶液中一些成分會干擾基因組DNA與硝酸纖維膜或尼龍膜結合等因素，導致其實驗的差異性較高，加之其操作繁瑣，試劑昂貴等因素，逐步被目前其它檢測方法取代。

（2）PCR法

PCR法因為操作簡單、重復性好和經濟等因素是目前檢測AAV基因組滴度最廣泛的方法。PCR法目前常用的包括qPCR法和微滴式數(shù)字PCR法（ddPCR），qPCR作為第二代PCR方法，目前是各個研究機構及其藥企采用最廣泛的AAV基因組滴度定量方法。而微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）被稱為第三代PCR技術，作為一種新興技術與舊的PCR技術（例如qPCR）相比，可針對核酸分子做更精確的定量分析。微滴式數(shù)字PCR的創(chuàng)新之處在于標準PCR反應體系經過微滴發(fā)生，將目標分子稀釋到多個微滴中，每個微滴大體上只包含一個或不包含目標DNA模板，實現(xiàn)”單分子模板PCR擴增”，擴增結束后含有目標分子模板的微滴會給出熒光信號，最終根據泊松分布原理以及陽性微滴的比例，分析軟件可計算給出目的分子的濃度或拷貝數(shù)。因此，無需標準曲線即可對目標分子進行絕對定量。

相對于傳統(tǒng)的qPCR方法，ddPCR在定量準確性、靈敏度及穩(wěn)定性方面具有顯著優(yōu)勢。更準確可靠的病毒載體滴度對毒理學及臨床相關的給藥劑量范圍研究至關重要。若滴度定量虛高，則實際藥效可能太低，可能無療效；若滴度定量虛低，則可能導致嚴重的副作用，例如細胞因子風暴。

與qPCR相比，ddPCR不需要依賴多個擴增循環(huán)來確定每個樣品中相對于標準曲線的核酸含量，即ddPCR允許對樣品中存在的目標核酸分子進行絕對而非相對標曲的“相對”定量及相對內參的相對定量。qPCR結果的準確性、精確度與實驗中使用的標準曲線直接相關，目標分子定量結果的準確性將取決于標準曲線的優(yōu)化情況。在標曲樣本與目標樣本間擴增的差異（例如，標曲DNA的高級結構與待測目標DNA分子的高級結構可能存在明顯差異）可能導致針對目標DNA定量的明顯誤差，因為不同結構的DNA（環(huán)形、超螺旋、線性；單鏈、雙鏈；不同堿基序列引起的高級結構等）具有不同的擴增效率。因此，使用未優(yōu)化的標準曲線將導致絕對定量結果不準確，這可能是不同實驗室間qPCR定量結果存在顯著差異的重要來源。有研究表明：qPCR定量對DNA標準品中二級結構的抑制作用敏感，這可能導致高估的病毒滴度，而ddPCR定量目標分子，其最終定量結果不受DNA二級結構影響，如下圖所示。綜上所述，相對qPCR，無需標準曲線是ddPCR定量結果準確性和穩(wěn)定性相對更高的原因之一。

在多數(shù)PCR基礎的反應中往往會存在多種化學特性的抑制劑，這些成分存在于樣品中，可能與DNA共純化獲得且難以去除。由于ddPCR對影響PCR擴增效率的污染物的敏感性較低，這進一步提高了ddPCR準確性和靈敏度。而qPCR技術定量原理是需測樣品與標準品之間Ct值的相對定量，若需測樣本或標準品中存在抑制物，則PCR效應將受影響，可能導致依賴標準曲線定量的結果不準確，若樣品中的PCR抑制物抑制效應明顯，則會明顯降低qPCR靈敏度。

以AAV滴度檢測為例，AAV滴度檢測一般要對基因組進行抽提操作，且在定量其滴度前，需要用DNA酶I對其進行消化處理，以降低游離DNA對AAV定量的影響。另外，若是AAV粗品，則其中會含有大量的核酸、雜質蛋白等生物大分子，因此，無論是AAV純品還是粗純產品，其樣本PCR反應體系中都會含有相對多的酶、衣殼蛋白或其它雜質蛋白等抑制PCR反應的成分，這些成分會干擾qPCR準確定量，可能導致qPCR定量的AAV滴度批間或批內差異大，不能很好滿足基因治療產品批內/批間穩(wěn)定性要求。AAV定量急需一種定量誤差小、準確且穩(wěn)定性好的方法，據調研，微滴式數(shù)字PCR技術在這方面具有明顯優(yōu)勢，且已受到越來越多業(yè)內人士的青睞。

有研究表明，ddPCR技術定量下游純化過程中的AAV樣本，無論是DNA酶處理組，DNA酶和蛋白酶K處理組，其結果CV值均小于qPCR檢測數(shù)據，說明ddPCR檢測AAV樣本的穩(wěn)定性高于qPCR技術。

有研究報道，在qPCR和ddPCR技術方法的直接比較中，針對單鏈AAV載體基因組的絕對定量，dPCR的靈敏度是qPCR的四倍。

（3）分光光度法

二、生物學滴度

1、感染滴度

測定AAV感染滴度的目的在于確定其基因組是否轉移到細胞核并進行復制，AAV基因組轉移至細胞核是其成功表達基因治療產物的前提，感染滴度與AAV入胞后的轉基因表達效率沒有明顯關系，因此，不受轉基因表達效率的干擾，有利于含不同基因表達框的AAV制品間的比較。AAV感染不會導致細胞病變效應，因此，空斑實驗（plaqueassays）不能用于確定其感染滴度；但是，在輔助病毒存在的情況下，可以誘導AAV基因組的復制，通過PCR檢測或探針雜交法可進行感染滴度檢測。

（1）半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量法（TCID50）

目前廣泛使用的感染滴度測定方法之一是TCID50法，該方法一般利用腺病毒作為輔助病毒，在輔助病毒存在情況下，AAV經10倍倍比稀釋后于96孔板中感染AAV-rep和cap表達細胞系，之后通過PCR檢測判定陰性與陽性孔數(shù)量，采用組織培養(yǎng)半數(shù)感染劑量公式—Spearman-Karber公式來計算感染滴度（Alt,Nadja, et al. Biologicals 44.5 (2016): 291-305.）。

目前AAV采用TCID50法面臨的挑戰(zhàn)是精密度差，變異系數(shù)大，多數(shù)文獻發(fā)表的TCID50感染滴度結果%CV值＞70%，其中輔助病毒的穩(wěn)定性、細胞類型、細胞數(shù)量、PCR引物體系、實驗人員的操作等眾多因素都會影響其定量數(shù)據，因此，對實驗環(huán)境、實驗參數(shù)控制等要求較高。由于對實驗環(huán)境、實驗操作參數(shù)等要求嚴格，目前國內大多數(shù)AAV基因治療研發(fā)企業(yè)不具備AAVTCID50感染滴度檢測能力，往往選擇檢測外包。目前，國內專業(yè)的針對AAV載體服務的CRO&CDMO企業(yè)，例如宜明細胞等具備上述檢測技術平臺，已服務了多個成功提交IND申報或研究者發(fā)起的臨床試驗研究用的臨床級別的AAV產品的批放行檢測。

（2）ICA法、HSVICA法和RCA法

RCA法（Replicationcenterassay）是較早期的一種檢測方法，以腺病毒作為輔助病毒，同時需要野生型AAV（wtAAV）來提供AAV-rep和cap，AAV感染細胞24~48h后，細胞被轉移到膜上，通過與與標記探針雜交來檢測感染中心（代表單個感染的細胞），陽性信號表明AAV成功入胞、脫殼，且具有復制能力，如上所述，該方法無法檢測目的基因是否能夠成功表達。

感染中心檢測法(infectious center assay，ICA)可以認為是RCA法的改進版，采用AAV-rep和cap穩(wěn)轉細胞系作為AAV感染細胞，無需wtAAV共感染，避免或減少了實驗環(huán)境中wtAAV污染。此外，還可以采用復制缺陷型單純皰疹病毒（HSV）來替代腺病毒和wtAAV提供給RCA法所需的所有輔助元件，無需輔助性病毒，進一步降低了復制型病毒的污染風險。

2、轉導滴度

轉導滴度是將AAV經梯度稀釋后，感染實驗細胞，通過檢測目的基因（或轉基因）的表達情況來判定是否陽性，根據陽性細胞數(shù)量或陽性孔數(shù)量，結合病毒稀釋度來計算轉導滴度，其計量單位為轉導單位（Transductionunit,TU)。實際操作過程中，提高檢測靈敏度，往往采用輔助病毒共感染的方式來提高AAV轉基因的表達率，其計量單位為增強的轉導單位（Enhancedtransduction unit，ETU）。

目前，轉導滴度的測定一般采用細胞株體外實驗方式來進行檢測，而非采用AAV基因治療藥物的靶細胞。轉基因表達效率與細胞類型有一定的關系，因此，能采用靶細胞或與其相近的細胞類型，檢測出的轉導滴度對臨床前實驗或臨床試驗才具有較好的指導意義。

綜上所述，每種方法也都有各自的優(yōu)勢與缺點，每種定量方法僅能檢測某些理化滴度指標或某一生物學滴度，一種方法無法檢測所有滴度指標；且都要在檢測通量和分辨率之間進行權衡取舍。